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EP 1 694 829 B1
6) Autres applications

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[0397] Des virus vaccine recombinants de troisième génération sont construits en substituant les séquences sauvages
des gènes S et Ssol par des gènes synthétiques optimisés pour l’expression en cellules de mammifères, décrits cidessus. Ces virus vaccine recombinants sont susceptibles d’exprimer des quantités plus importantes des antigènes S
et Ssol et donc de présenter une immunogénicité accrue.
[0398] Le virus vaccine recombinant VV-TN-Ssol peut être utilisé pour la production en quantité et la purification de
l’antigène Ssol en vue d’applications diagnostiques (sérologie par ELISA) et vaccinales (vaccin sous-unitaire).
Exemple 17 : Virus recombinant de la rougeole exprimant la protéine de spicule (S) du coronavirus associé
au SRAS (SRAS-CoV). Applications vaccinales.
1) Introduction

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[0399] Le vaccin rougeole (MV) induit chez l’homme une immunité protectrice de longue durée après une seule
injection (Hilleman, 2002, Vaccine, 20 : 651-665). La protection conférée est très robuste et repose sur l’induction d’une
réponse en anticorps et d’une réponse cellulaire CD4 et CD8. Le génome du MV est très stable et aucune réversion
vers la virulence des souches vaccinales n’a jamais été observée. Le virus de la rougeole appartient au genre des
Morbillivirus de la famille des Paramyxoviridae ; c’est un virus enveloppé dont le génome est un ARN monocaténaire
de polarité négative de 16kb (figure 40A) et dont le cycle de réplication exclusivement cytoplasmique exclut toute
possibilité d’intégration dans le génome de l’hôte. Le vaccin rougeole est ainsi l’un des vaccins vivants les plus efficaces
et les plus sûrs utilisés dans la population humaine. L’équipe de Frédéric Tangy a développé récemment un vecteur
d’expression sur la base de la souche Schwarz du virus de la rougeole, qui est la souche atténuée la plus sûre et la
plus utilisée chez l’homme comme vaccin contre la rougeole. Cette souche vaccinale peut être isolée à partir d’un clone
moléculaire infectieux en conservant son immunogénicité chez les primates ainsi que chez la souris susceptible à
l’infection. Elle constitue, après insertion d’unités de transcription supplémentaires, un vecteur pour l’expression de
séquences hétérologues (Combredet, 2003, J. Virol. 77 : 11546-11554). En outre, un MV Schwarz recombinant exprimant
la glycoprotéine d’enveloppe du virus West Nile (WNV) induit une réponse en anticorps efficace et de longue durée qui
protège la souris d’une infection d’épreuve létale par le WNV (Despres et al, 2004, J. Infect. Dis., sous presse). Toutes
ces caractéristiques font de la souche atténuée Schwarz du virus de la rougeole un candidat vecteur extrêmement
prometteur pour la construction de nouveaux vaccins vivants recombinants.
[0400] Le but de cet exemple est d’évaluer la capacité de virus recombinants de la rougeole (MV) exprimant différents
antigènes du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV) à constituer de nouveaux candidats vaccins contre le SRAS.
[0401] Les inventeurs se sont intéressés à la protéine de spicule (S) du SRAS-CoV, qui permet d’induire après
immunisation génique chez l’animal des anticorps neutralisants l’infectivité du SRAS-CoV, ainsi qu’à une forme soluble
et sécrétée de cette protéine, le polypeptide Ssol, qui est composé de l’ectodomaine (aa 1-1193) de la S fusionné en
son extrémité C-ter à une étiquette FLAG (DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG. Ce polypeptide
Ssol présente une antigénicité similaire à celle de la protéine S et permet, après injection à la souris sous la forme d’une
protéine purifiée adjuvée en hydroxide d’aluminium, l’induction de titres élevés d’anticorps neutralisants contre le SRASCoV.
[0402] Les différentes formes du gène S ont été introduites sous la forme d’une unité de transcription supplémentaire
entre les gènes P (phosphoprotéine) et M (matrice) dans le cADN de la souche Schwarz du MV précédemment décrite
(Combredet, 2003, J. Virol. 77 : 11546-11554 ; Demande EP N° 02291551.6 du 20 juin 2002, et Demande EP n°
02291550.8 du 20 juin 2002). Après avoir isolé les virus recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol et
vérifié leur capacité à exprimer l’antigène S du SRAS-CoV, leur capacité à induire chez la souris puis chez le singe une
réponse immunitaire protectrice contre le SRAS est testée.
2) Construction des virus recombinants

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[0403] Le plasmide pTM-MVSchw-ATU2 (figure 40B) contient un cADN infectieux correspondant à l’antigénome de
la souche vaccinale Schwarz du virus de la rougeole (MV) dans lequel une unité de transcription supplémentaire (ATU)
a été introduite entre les gènes P (phosphoprotéine) et M (matrice) (Combredet, 2003, Journal of Virology, 77 :
11546-11554). Des génomes recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol du virus de la rougeole ont
été construits par l’insertion des ORFs de la protéine S et du polypeptide Ssol au sein de l’unité de transcription supplémentaire du vecteur MVSchw-ATU2.
[0404] Pour cela, un fragment d’ADN contenant le cADN de la S du SRAS-CoV a été amplifié par PCR à l’aide des
oligonucléotides 5’-ATACGTACGA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3’ et 5’-ATAGCGCGCT CATTATGTGT AATGTAATTT GACACCCTTG-3’ en utilisant le plasmide pcDNA-S comme matrice puis inséré dans le

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