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EP 1 694 829 B1
(suite)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

sérum

patient

jour de prélèvement

032634

THA

15

032541

PHV

10

032542

NIH

17

032552

VTT

8

032633

PTU

16

[0389] Des phases solides sensibilisées par le polypeptide recombinant Ssol ont été préparées par adsorption d’une
solution de polypeptide Ssol purifié à 4 Pg/ml en PBS dans les puits d’une plaque ELISA. Les plaques sont incubées
une nuit à 4°C puis lavées avec du tampon PBS-Tween (PBS, 0,1% Tween20). Après lavage en PBS-tween, les sérums
à tester (100 Pl) sont dilués au 1/100 et 1/400 dans du tampon PBS-lait écrémé-Tween (PBS, 3% lait écrémé, 0,1%
Tween) puis ajoutés dans les puits de la plaque ELISA sensibilisée. Les plaques sont incubées 1h à 37°C. Après 3
lavages avec du tampon PBS-Tween, le conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxidase (réf NA933V, Amersham)
dilué au 1/4000 dans du tampon PBS-lait écrémé-Tween est ajouté puis les plaques sont incubées une heure à 37°C.
Après 6 lavages avec du tampon PBS-Tween, le chromogène (TMB) et le substrat (H2O2) sont ajoutés et les plaques
sont incubées 10 minutes à l’abri de la lumière. La réaction est arrêtée par ajout d’une solution 1M de H3PO4 puis
l’absorbance est mesurée à 450 nm avec une référence à 620nm.
[0390] Les tests ELISA (figure 38) démontrent que le polypeptide recombinant Ssol est reconnu spécifiquement par
les anticorps sériques de patients atteints de SRAS prélevés en phase moyenne ou tardive de l’infection (≥ 10 jours
après le début des symptômes), alors qu’il n’est pas reconnu de façon significative par les anticorps sériques des sérums
témoins de sujets non atteints de SRAS.
[0391] En conclusion, ces résultats démontrent que le polypeptide recombinant Ssol peut être purifié à partir du
surnageant de cellules de mammifères infectées par le virus vaccine recombinant W-TN-Ssol et être utilisé comme
antigène pour la mise au point d’un test ELISA de diagnostic sérologique de l’infection par le SRAS-CoV.
5) Applications vaccinales
[0392] L’immunogénicité des virus vaccine recombinants a été étudiée chez la souris.
[0393] Pour cela, des groupes de 7 souris BALB/c ont été immunisés par voie i.v. à deux reprises à 4 semaines
d’intervalle par 106 u.f.p. de virus vaccine recombinants VV-TG, VV-TG-S, W-TG-Ssol, W-TN, W-TN-S et VV-TN-Ssol
ainsi que, à titre de contrôle, VV-TG-HA qui dirige l’expression de l’hémagglutinine de la souche A/PR/8/34 du virus de
la grippe. Les sérums immuns ont été prélevés 3 semaines après chacune des immunisations (IS1, IS2).
[0394] Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des groupes par ELISA indirect en utilisant un lysat
de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme antigène et à titre de contrôle, un lysat de cellules VeroE6 non
infectées. Les titres (TI) en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO
spécifique de 0,5 après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de souris couplé à la peroxidase (NA931V,
Amersham) et du TMB additionné de H2O2 (KPL). Cette analyse (figure 39A) montre que l’immunisation par le virus
VV-TG-S et W-TN-S induit chez la souris dès la première immunisation des anticorps dirigés contre la forme native de
la protéine de spicule du SRAS-CoV présente dans le lysat de cellules VeroE6 infectées. Les réponses induites par le
virus VV-TN-S sont plus élevées que celles induites par le virus VV-TG-S après la première (TI=740 et TI=270 respectivement) et la deuxième (TI=3230 et TI=600 respectivement) immunisation. Le virus VV-TN-Ssol induit de forts titres
d’anticorps anti-SRAS-CoV après deux immunisations (TI=640), alors que le virus VV-TG-Ssol induit une réponse à la
limite de la détection (TI=40).
[0395] Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des groupes pour leur capacité à séroneutraliser
l’infectivité du SRAS-CoV. 4 points de séroneutralisation sur cellules FRhK-4 (100 TCID50 de SRAS-CoV) sont réalisés
pour chacune des dilutions de raison 2 testées à partir du 1/20. Le titre séroneutralisant est calculé selon la méthode
de Reed et Munsch comme l’inverse de la dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4. Cette analyse montre que
les anticorps induits chez la souris par les virus vaccine exprimant la protéine S ou le polypeptide Ssol sont neutralisants
et que les virus à promoteurs synthétiques sont des immunogènes plus efficaces que les virus porteurs du promoteur
7.5K : les titres les plus élevés (640) sont observés après 2 immunisations par le virus VV-TN-S (figure 39B).
[0396] Le pouvoir protecteur des anticorps neutralisants induits chez la souris après immunisation par les virus vaccine
recombinants est évalué à l’aide d’une infection d’épreuve par le SRAS-CoV.

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