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Titre: NOUVELLE SOUCHE DE CORONAVIRUS ASSOCIE AU SRAS ET SES APPLICATIONS. - European Patent Office - EP 1694829 B1

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(19)

&
(11)


EP 1 694 829 B1

FASCICULE DE BREVET EUROPEEN

(12)

(45) Date de publication et mention
de la délivrance du brevet:
04.08.2010 Bulletin 2010/31

(51) Int Cl.:
C12N 7/00 (2006.01)
(86) Numéro de dépôt international:
PCT/FR2004/003106

(21) Numéro de dépôt: 04805625.3

(87) Numéro de publication internationale:
WO 2005/056584 (23.06.2005 Gazette 2005/25)

(22) Date de dépôt: 02.12.2004

(54) NOUVELLE SOUCHE DE CORONAVIRUS ASSOCIE AU SRAS ET SES APPLICATIONS.

NEUER MIT SARS VERBUNDEN CORONAVIRUS STAMM UND SEINE VERWENDUNGEN
NOVEL STRAIN OF SARS-ASSOCIATED CORONAVIRUS AND APPLICATIONS THEREOF
(84) Etats contractants désignés:
AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR
HU IE IS IT LI LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR
(30) Priorité: 02.12.2003 FR 0314151
02.12.2003 FR 0314152
(43) Date de publication de la demande:
30.08.2006 Bulletin 2006/35
(60) Demande divisionnaire:
10005885.8

EP 1 694 829 B1

(73) Titulaires:
• INSTITUT PASTEUR
75724 Paris Cedex 15 (FR)
• CENTRE NATIONAL DE
LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
75794 Paris Cedex 16 (FR)
• UNIVERSITE PARIS VII
75251 Paris Cedex 05 (FR)
(72) Inventeurs:
• VAN DER WERF, Sylvie
F-91190 Gif-sur-yvette (FR)
• ESCRIOU, Nicolas
F-75014 Paris (FR)
• CRESCENZO-CHAIGNE, Bernadette
F-92200 Neuilly-sur-seine (FR)
• MANUGUERRA, Jean-Claude
F-75018 Paris (FR)
• KUNST, Frederik,
Inst. Pasteur
Bureau des Brevets et Inventions
75724 Paris Cedex 15 (FR)
• CALLENDRET, Benoît
F- 92000 Nanterre (FR)

• BETTON, Jean-Michel
75014 Paris (FR)
• LORIN, Valérie
92120 Montrouge (FR)
• GERBAUD, Sylvie
94100 Saint Maur Des Fosses (FR)
• BURGUIERE, Ana Maria
92140 Clamart (FR)
• AZEBI, Saliha
94400 Vitry-sur-seine (FR)
• CHARNEAU, Pierre
75005 Paris (FR)
• TANGY, Frédéric
93260 Les Lilas (FR)
• COMBREDET, Chantal
75017 Paris (FR)
• DELAGNEAU, Jean-François
78170 La Celle Saint Cloud (FR)
• MARTIN, Monique
92290 Chatenay Malabry (FR)
(74) Mandataire: Marcadé, Véronique et al
Cabinet Ores
36, rue de St Pétersbourg
75008 Paris (FR)
(56) Documents cités:
• DATABASE EMBL 22 avril 2003 (2003-04-22),
XP002294758 Database accession no. AY278489
• DATABASE EMBL 10 juin 2003 (2003-06-10),
XP002294760 Database accession no. AY290752
• DATABASE UNIPROT 10 octobre 2003
(2003-10-10), XP002294761 Database accession
no. P59595

Il est rappelé que: Dans un délai de neuf mois à compter de la publication de la mention de la délivrance du brevet
européen au Bulletin européen des brevets, toute personne peut faire opposition à ce brevet auprès de l'Office européen
des brevets, conformément au règlement d'exécution. L'opposition n'est réputée formée qu'après le paiement de la taxe
d'opposition. (Art. 99(1) Convention sur le brevet européen).
Printed by Jouve, 75001 PARIS (FR)

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• MARRA M A ET AL: "The genome sequence of
the SARS-associated coronavirus" SCIENCE,
AMERICAN ASSOCIATION FOR THE
ADVANCEMENT OF SCIENCE,, US, vol. 300, no.
5624, 30 mai 2003 (2003-05-30), pages 1399-1404,
XP002269483 ISSN: 0036-8075
• CHE X-Y ET AL: "RAPID AND EFFICIENT
PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES
AGAINST SARS-ASSOCIATED CORONAVIRUS
NUCLEOCAPSID PROTEIN BY IMMUNIZING
MICE" DI YI JUNYI DAXUE XUEBAO - ACADEMIC
JOURNAL OF FIRST MEDICAL COLLEGE OF
PLA, GAI KAN BIANJISHI, GUANGZHOU, CN, vol.
23, no. 7, juillet 2003 (2003-07), pages 640-642,
XP008028243 ISSN: 1000-2588
• WANG J ET AL: "ASSESSMENT OF
IMMUNOREACTIVE SYNTHETIC PEPTIDES
FROM THE STRUCTURAL PROTEINS OF
SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME
CORONAVIRUS" CLINICAL CHEMISTRY,
AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL
CHEMISTRY. WINSTON, US, vol. 49, no. 12, 13
novembre 2003 (2003-11-13), pages 1989-1996,
XP001182489 ISSN: 0009-9147

• SHI Y ET AL: "DIAGNOSIS OF SEVERE ACUTE
RESPIRATORY SYNDROME (SARS) BY
DETECTION OF SARS CORONAVIRUS
NUCLEOCAPSID ANTIBODIES IN AN ANTIGENCAPTURING ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY" JOURNAL OF
CLINICAL MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC,
US, vol. 41, no. 12, décembre 2003 (2003-12),
pages 5781-5782, XP008028263 ISSN: 0095-1137
• LIU G ET AL: "The C-Terminal Portion of the
Nucleocapsid Protein Demonstrates SARS-CoV
Antigenicity" GENOMICS, PROTEOMICS AND
BIOINFORMATICS, vol. 1, no. 3, 2003, pages
193-197, XP001183377
• POON LEO L M ET AL: "Rapid diagnosis of a
coronavirus associated with severe acute
respiratory syndrome (SARS)" CLINICAL
CHEMISTRY, AMERICAN ASSOCIATION FOR
CLINICAL CHEMISTRY. WINSTON, US, vol. 49,
no. 6 Pt 1, juin 2003 (2003-06), pages 953-955,
XP002288942 ISSN: 0009-9147

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Description

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[0001] La présente invention est relative à une nouvelle souche de coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu
sévère (SRAS), issue d’un prélèvement répertorié sous le n° 031589 et prélevé à Hanoi (Vietnam), à des molécules
d’acide nucléique issues de son génome, aux protéines et peptides codés par lesdites molécules d’acide nucléique ainsi
qu’à leurs applications, notamment en tant que réactifs de diagnostic et/ou comme vaccin.
[0002] Le coronavirus est un virus à ARN monocaténaire, de polarité positive, d’approximativement 30 kilobases qui
se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes ; l’extrémité 5’ du génome a une structure en coiffe et l’extrémité 3’
comporte une queue polyA. Ce virus est enveloppé et comprend, à sa surface, des structures péplomériques dénommées
spicules.
[0003] Le génome comprend les cadres ouverts de lecture ou ORF suivants, de son extrémité 5’ vers son extrémité
3’ : ORF1a et ORF1b correspondant aux protéines du complexe de transcription-réplication, et ORF-S, ORF-E, ORFM et ORF-N correspondant aux protéines structurales S, E, M et N. Il comprend également des ORFs correspondant
à des protéines de fonction inconnue codées par : la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant cette
dernière, la région située entre l’ORF-M et l’ORF-N, et la région incluse dans l’ORF-N.
[0004] La protéine S est une glycoprotéine membranaire (200-220 kDa) qui se présente sous la forme de spicules ou
"Spike" émergeant de la surface de l’enveloppe virale. Elle est responsable de l’attachement du virus aux récepteurs
de la cellule hôte et de l’induction de la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire.
[0005] La petite protéine d’enveloppe (E) également dénommée sM (small membrane) qui est une protéine transmembranaire non glycosylée d’environ 10 kDa, est la protéine présente en plus faible quantité dans le virion. Elle joue
un rôle moteur dans le processus de bourgeonnement des coronavirus qui se produit au niveau du compartiment
intermédiaire dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi
[0006] La protéine M ou protéine de matrice (25-30 kDa) est une glycoprotéine membranaire plus abondante qui est
intégrée dans la particule virale par une interaction M/E, tandis que l’incorporation de S dans les particules est dirigée
par une interaction S/M. Elle semble être importante pour la maturation virale des coronavirus et pour la détermination
du site au niveau duquel les particules virales sont assemblées.
[0007] La protéine N ou protéine de nucléocapside (45-50 kDa) qui est la plus conservée parmi les protéines structurales des coronavirus, est nécessaire pour encapsider l’ARN génomique puis pour diriger son incorporation dans le
virion. Cette protéine est vraisemblablement également impliquée dans la réplication de l’ARN.
[0008] Lorsqu’une cellule hôte est infectée, le cadre de lecture (ORF) situé en 5’ du génome viral est traduit en une
polyprotéine qui est clivée par les protéases virales et libère alors plusieurs protéines non-structurales telles que l’ARNpolymérase ARN dépendante (Rep) et l’ATPase hélicase (Hel). Ces deux protéines sont impliquées dans la réplication
du génome viral ainsi que dans la génération de transcrits qui sont utilisés dans la synthèse des protéines virales. Les
mécanismes par lesquels ces ARNms sub-génomiques sont produits, ne sont pas complètement compris ; cependant
des faits récents indiquent que les séquences de régulation de la transcription à l’extrémité 5’ de chaque gène représentent
des signaux qui régulent la transcription discontinue des ARNms sub-génomiques.
[0009] Les protéines de la membrane virale (protéines S, E et M) sont insérées dans le compartiment intermédiaire,
alors que l’ARN répliqué (brin +) s’assemble avec la protéine N (nucléocapside). Ce complexe protéine-ARN s’associe
ensuite avec la protéine M incluse dans les membranes du réticulum endoplasmique et les particules virales se forment
lorsque le complexe de la nucléocapside bourgeonne dans le réticulum endoplasmique. Le virus migre ensuite à travers
le complexe du Golgi et éventuellement sort de la cellule, par exemple par exocytose. Le site de l’attachement du virus
à la cellule hôte se trouve au niveau de la protéine S.
[0010] Les coronavirus sont responsables de 15 à 30 % des rhumes chez l’Homme et d’infections respiratoires ou
digestives chez les animaux, notamment le chat (FIPV : Feline infectious peritonitis virus), la volaille (IBV : Avian Infectious bronchitis virus), la souris (MHV : Mouse Hepatitis virus), le porc (TGEV : Transmissible gastroenterititis virus,
PEDV : Porcine Epidemic Diarrhea virus, PRCoV : Porcine Respiratory Coronavirus, HEV : Hemagglutinating encephalomyelitis Virus) et les bovins (BcoV : Bovine coronavirus).
[0011] En général, chaque coronavirus n’affecte qu’une seule espèce ; chez les individus immunocompétents, l’infection induit des anticorps éventuellement neutralisants et une immunité cellulaire, capables de détruire les cellules
infectées.
[0012] Une épidémie de pneumonie atypique, dénommée syndrome respiratoire aigu sévère (SARS ou Severe acute
respiratory syndrome, SRAS en français) s’est propagée dans différents pays (Vietnam, Hong-Kong, Singapour, Thaïlande et Canada) au cours du premier trimestre 2003, à partir d’un foyer initial apparu en Chine dans le dernier trimestre
de 2002. La sévérité de cette maladie est telle que son taux de mortalité est d’environ 3 à 6 %. La détermination de
l’agent causatif de cette maladie a été entreprise par de nombreux laboratoires, à travers le monde.
[0013] En mars 2003, un nouveau coronavirus (SARS-CoV, SARS virus ou virus SRAS, en français) a été isolé, en
association avec des cas de syndrome respiratoire aigu sévère (T.G.KSIAZEK et al., The New England Journal of
Medicine, 2003, 348, 1319-1330 ; C. DROSTEN et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1967-1976 ;

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Peiris et al., Lancet, 2003, 361, 1319-).
[0014] Des séquences génomiques de ce nouveau coronavirus ont ainsi été obtenues, notamment celles de l’isolat
Urbani (Genbank n° d’accès AY274119.3 et A. MARRA et al., Science, May 1, 2003, 300, 1399-1404) et de l’isolat de
Toronto (Tor2, Genbank n° d’accès AY 278741 et A. ROTA et al., Science, 2003, 300, 1394-1399).
[0015] L’organisation du génome est comparable à celle des autres coronavirus connus permettant ainsi de confirmer
l’appartenance du SARS-CoV à la famille des Coronaviridae ; les cadres ouverts de lecture ORF1a et 1b et les cadres
ouverts de lecture correspondant aux protéines S, E, M, et N, ainsi qu’à des protéines codées par : la région située entre
l’ORF-S et l’ORF-E (ORF3), la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant l’ORF-E (ORF4), la région située
entre l’ORF-M et l’ORF-N (ORF7 à ORF11) et la région correspondant à l’ORF-N (ORF13 et ORF14), ont notamment
été identifiées.
[0016] Sept différences ont été mises en évidence entre les séquences des isolats Tor2 et Urbani ; 3 correspondent
à des mutations silencieuses (c/t en position 16622 et a/g en position 19064 de l’ORF1b, t/c en position 24872 de l’ORFS) et 4 modifient la séquence en acides aminés de respectivement : les protéines codées par l’ORF1a (c/t en position
7919 correspondant à la mutation A/V), la protéine S (g/t en position 23220 correspondant à la mutation A/S), la protéine
codée par l’ORF3 (a/g en position 25298 correspondant à la mutation R/G) et de la protéine M (t/c en position 26857
correspondant à la mutation S/P).
[0017] En outre, l’analyse phylogénétique montre que le SARS-CoV est éloigné des autres coronavirus et qu’il est
apparu, ni par mutation de coronavirus respiratoires humains, ni par recombinaison entre des coronavirus connus (pour
une revue, voir Holmes, J.C.I., 2003, 111, 1605-1609).
[0018] La mise en évidence et la prise en compte de nouveaux variants sont importantes pour la mise au point de
réactifs de détection et de diagnostic du SRAS suffisamment sensibles et spécifiques ainsi qu’à des compositions
immunogènes aptes à protéger des populations contre des épidémies de SRAS.
[0019] Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence une autre souche de coronavirus associé au SRAS, qui se
distingue des isolats Tor2 et Urbani.
[0020] La présente invention a donc pour objet, une souche isolée ou purifiée de coronavirus humain associé au
syndrome respiratoire aigu sévère, caractérisée en ce que son génome présente sous la forme d’ADN complémentaire
un codon sérine en position 23220-23222 du gène de la protéine S ou un codon glycine en position 25298-25300 du
gène de l’ORF3, et un codon alanine en position 7918-7920 de l’ORF1a ou un codon sérine en position 26857-26859
du gène de la protéine M, lesdites positions étant indiquées en référence à la séquence Genbank AY274119.3.
[0021] Selon un mode de réalisation avantageux de ladite souche, l’équivalent ADN de son génome présente une
séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 ; cette souche de coronavirus est issue du prélèvement de
lavage bronchoalvéolaire d’un patient atteint de SRAS, répertorié sous le n° 031589 et effectué à l’hôpital français de
Hanoi (Vietnam).
[0022] Conformément à l’invention, ladite séquence SEQ ID NO :1 est celle de l’acide désoxyribonucléique correspondant à la molécule d’acide ribonucléique du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus.
[0023] La séquence SEQ ID NO : 1 se distingue de la séquence Genbank AY274119.3 (isolat Tor2) en ce qu’elle
possède les mutations suivantes :
-

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-

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[0024] En outre, la séquence SEQ ID NO : 1 se distingue de la séquence Genbank AY278741 (isolat Urbani) en ce
qu’elle possède les mutations suivantes :
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g/t en position 23220 ; le codon alanine (gct) en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de
Tor2 est remplacé par un codon sérine (tct),
a/g en position 25298 ; le codon arginine (aga) en position 11 de la séquence en acide aminés de la protéine codée
par l’ORF3 de Tor 2 est remplacé par un codon glycine (gga).

t/c en position 7919 ; le codon valine (gtt) en position 2552 de la séquence en acides aminés de la protéine codée
par l’ORF1a est remplacé par un codon alanine (gct),
t/c en position 16622 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par
l’ORF1b (mutation silencieuse),
g/a en position 19064 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par
l’ORF1b (mutation silencieuse),
c/t en position 24872 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine S, et
c/t en position 26857 : le codon proline (ccc) en position 154 de la séquence en acides aminés de la protéine M est
remplacé par un codon sérine (tcc).

[0025] En l’absence de mention particulière, les positions des séquences nucléotidiques et peptidiques sont indiquées
en référence à la séquence Genbank AY274119.3.

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[0026] La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa
séquence est celle du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus.
[0027] Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide il présente la séquence SEQ ID NO : 1.
[0028] Les Inventeurs décrivent également un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence
hybride dans des conditions de forte stringence avec la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus.
[0029] Les termes « isolé ou purifié » signifient modifié « par la main de l’homme » à partir de l’état naturel ; autrement
dit si un objet existe dans la nature, il est dit isolé ou purifié s’il a été modifié ou extrait de son environnement naturel
ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou une protéine/un peptide naturellement présent dans un organisme vivant
n’est ni isolé, ni purifié ; en revanche le même polynucléotide ou protéine /peptide séparé des molécules coexistantes
dans son environnement naturel, obtenu par clonage, amplification et/ou synthèse chimique est isolé au sens de la
présente invention. De plus, un polynucléotide ou une protéine/peptide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par toute autre méthode, est « isolé » même s’il est présent dans ledit organisme.
Le terme purifié tel qu’utilisé dans la présente invention, signifie que les protéines /peptides selon l’invention sont
essentiellement libres d’association avec les autres protéines ou polypeptides, comme l’est par exemple le produit purifié
de la culture de cellules hôtes recombinantes ou le produit purifié à partir d’une source non-recombinante.
[0030] On entend par conditions d’hybridation de forte stringence, des conditions de température et de force ionique
choisies de telle manière qu’elles permettent le maintien de l’hybridation spécifique et sélective entre polynucléotides
complémentaires.
[0031] A titre d’illustration, des conditions de forte stringence aux fins de définir les polynucléotides ci-dessus, sont
avantageusement les suivantes : l’hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation
à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution
0,15 M NaCl + 0, 015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt’s,
5 % de dextran sulfate et 1 % d’ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation pendant 20 heures à 42°C suivie de 2
lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le
dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C.
[0032] Les Inventeurs décrivent également un fragment représentatif du polynucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il est susceptible d’être obtenu, soit par l’utilisation d’enzymes de restriction dont les sites de reconnaissance et de coupure sont présents dans ledit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par amplification à l’aide
d’amorces oligonucléotidiques spécifiques dudit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par transcription in vitro,
soit par synthèse chimique.
[0033] Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment, il est sélectionné dans le groupe constitué par :
l’ADNc correspondant à au moins un cadre ouvert de lecture (ORF) choisi parmi : ORF1a, ORF1b, ORF-S, ORF-E,
ORF-M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11, ORF 13 et ORF 14, et l’ADNc correspondant aux extrémités 5’ ou 3’
non-codantes dudit polynucléotide.
[0034] Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit fragment présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par :
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les séquences SEQ ID NO : 2 et 4 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-S qui code pour la protéine S,
les séquences SEQ ID NO : 13 et 15 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-E qui code pour la protéine E,
les séquences séquence SEQ ID NO: 16 et 18 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-M qui code pour la
protéine M,
les séquences SEQ ID NO : 36 et 38 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-N qui code pour la protéine N,
les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement : aux ORF1a et ORF1b (ORF1ab, SEQ ID
NO : 31), aux ORF3 et ORF4 (SEQ ID NO : 7, 8), aux ORF 7 à 11 (SEQ ID NO : 19, 20), à l’ORF13 (SEQ ID NO :
32) et à l’ORF 14 (SEQ ID NO : 34), et
les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement aux extrémités 5’(SEQ ID NO : 39 et 72) et
3’ non-codantes (SEQ ID NO : 40, 73) dudit polynucléotide.

[0035] Les Inventeurs décrivent également un fragment de l’ADNc codant pour la protéine S, tel que défini ci-dessus,
caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :
5 et 6 (fragments Sa et Sb).
[0036] Les Inventeurs décrivent également un fragment de l’ADNc correspondant aux ORF1a et ORF1b tel que défini
ci-dessus, caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ
ID NO : 41 à 54 (fragments L0 à L12).
[0037] Les Inventeurs décrivent également un fragment du polynucléotide tel que défini ci dessus, caractérisé en ce
qu’il présente au moins 15 bases ou paires de bases consécutives de la séquence du génome de ladite souche incluant
au moins une de celles situées en position 7979, 16622, 19064, 23220, 24872, 25298 et 26857. De préférence, il s’agit
d’un fragment de 20 à 2500 bases ou paires de bases, de manière préférée de 20 à 400.

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[0038] La présente invention a également pour objet un fragment du plynucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé
en ce qu’il comprend les ou est constitué des bases ou de paires de bases consécutives des positions 7919 à 23220,
7919 à 25298, 16622 à 23220, 19064 à 23220, 16622 à 25298, 19064 à 25298, 23220 à 24872, 23220 à 26857, 24872
à 25298, ou 25298 à 26857.
[0039] Les Inventeurs décrivent également des amorces d’au moins 18 bases aptes à amplifier un fragment du génome
d’un coronavirus associé au SRAS ou de l’équivalent ADN de celui-ci.
[0040] Selon un mode de réalisation desdites amorces, elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par :
-

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-

-

la paire d’amorces n° 1 correspondant respectivement aux positions 28507 à 28522 (amorce sens, SEQ ID NO :
60) et 28774 à 28759 (amorce anti-sens, SEQ ID NO : 61) de la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus,
la paire d’amorces n° 2 correspondant respectivement aux positions 28375 à 28390 (amorce sens, SEQ ID NO :
62) et 28702 à 28687 (amorce anti-sens, SEQ ID NO : 63) de la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus.,
et
la paire d’amorces constituée des amorces SEQ ID Nos 55 et 56.

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[0041] Les Inventeurs décrivent également une sonde apte à détecter la présence du génome d’un coronavirus associé
au SRAS ou d’un fragment de celui-ci, caractérisée en ce qu’elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : les
fragments tels que définis ci-dessus et les fragments correspondant aux positions suivantes de la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus : 28561 à 28586, 28588 à 28608, 28541 à 28563 et 28565 à 28589 (SEQ ID NO : 64 à 67).
[0042] Les sondes et amorces telles que définies ci-dessus peuvent être marquées directement ou indirectement par
un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l’Homme du Métier, afin d’obtenir un signal
détectable et/ou quantifiable. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou l’125I.
Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l’avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents,
bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
[0043] Les Inventeurs décrivent des sondes et des amorces marquées dérivées des séquences précédentes.
[0044] De telles sondes et amorces sont utiles pour le diagnostic de l’infection par un coronavirus associé au SRAS.
[0045] Les Inventeurs décrivent également une méthode de détection d’un coronavirus associé au SRAS, à partir
d’un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu’elle comprend au moins :

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(a) l’extraction d’acides nucléiques présents dans ledit échantillon biologique,
(b) l’amplification d’un fragment de l’ORF-N par RT-PCR à l’aide d’une paire d’amorces telle que définie ci-dessus, et
(c) la détection par tout moyen approprié des produits d’amplifications obtenus en (b).
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[0046] Les produits d’amplifications (amplicons) en (b) sont de 268 pb pour la paire d’amorces n° 1 et de 328 pb pour
la paire d’amorces n°2.
[0047] Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l’étape (c) de détection est réalisée à l’aide d’au
moins une sonde correspondant aux positions 28561 à 28586, 28588 à 28608, 28541 à 28563 et 28565 à 28589 de la
séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus.
[0048] De préférence, le génome du coronavirus associé au SRAS est détecté et éventuellement quantifié par PCR
en temps réel, à l’aide de la paire d’amorces n°2 et des sondes correspondant aux positions 28541 à 28563 et 28565
à 28589 marquées avec des composés différents, notamment des agents fluorescents différents.
[0049] La RT-PCR en temps réel qui met en oeuvre cette paire d’amorces et cette sonde est très sensible puisqu’elle
permet de détecter 102 copies d’ARN et jusqu’à 10 copies d’ARN, elle est en outre fiable et reproductible.
[0050] Les Inventeurs décrivent des polydésoxyribonucléotides et des poly-ribonucléotides simple-brin, double-brin
et tripe-brin correspondant à la séquence du génome de la souche isolée de coronavirus et de ses fragments tels que
définis ci-dessus, ainsi qu’à leurs séquences complémentaires, sens ou anti-sens, notamment les ARN et les ADNc
correspondant à la séquence du génome et de ses fragments tels que définis ci-dessus.
[0051] Les Inventeurs décrivent également des fragments d’amplification obtenus à l’aide d’amorces spécifiques du
génome de la souche purifiée ou isolée tel que défini ci-dessus, notamment à l’aide d’amorces et de paires d’amorces
telles que définies ci-dessus, des fragments de restriction constitués par ou comprenant la séquence des fragments
tels que définis ci-dessus, des fragments obtenus par transcription in vitro à partir d’un vecteur contenant la séquence
SEQ ID NO : 1 ou un fragment tel que défini ci-dessus, ainsi que des fragments obtenus par synthèse chimique. Des
exemples de fragments de restriction sont déduits de la carte de restriction de la séquence SEQ ID NO : 1 illustrée par
la figure 13. Lesdits fragments sont, soit sous forme de fragments isolés, soit sous forme de mélanges de fragments.
Les Inventeurs décrivent également des fragments modifiés, par rapport aux précédents, par enlèvement, ou addition
de nucléotides dans une proportion d’environ 15 %, par rapport à la longueur des fragments ci-dessus et/ou modifiés
au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité

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d’hybridation avec les séquences d’ARN génomiques ou antigénomiques de l’isolat tel que défini ci-dessus.
[0052] Les molécules d’acide nucléique telles que définies ci-dessus sont obtenues par les méthodes classiques,
connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular
Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être
obtenues par amplification d’une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR ou bien par synthèse chimique totale ou
partielle.
[0053] Les Inventeurs décrivent également une puce ou filtre à ADN ou à ARN, caractérisé en ce qu’il comprend au
moins un polynucléotide ou l’un de ses fragments tels que définis ci-dessus.
[0054] Les puces ou filtres à ADN ou à ARN tels que définis ci-dessus sont préparés par les méthodes classiques,
connues en elles-mêmes, comme par exemple greffage chimique ou électrochimique d’oligonucléotides sur support de
verre ou de nylon.
[0055] Les Inventeurs décrivent également un vecteur de clonage et/ou d’expression recombinant, notamment un
plasmide, un virus, un vecteur viral ou un phage comprenant un fragment d’acide nucléique tel que défini ci-dessus. De
préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d’expression dans lequel ledit fragment d’acide nucléique est placé
sous le contrôle d’éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut
comprendre des séquences (étiquettes ou tag) fusionnées en phase avec l’extrémité 5’ et/ou 3’ dudit insert, utiles pour
l’immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur.
[0056] Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d’ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer
une molécule d’acide nucléique d’intérêt afin de l’introduire et de la maintenir dans une cellule hôte, sont connus en
eux-mêmes ; le choix d’un vecteur approprié dépend de l’utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication
de la séquence d’intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou
bien intégration dans le matériel chromosomique de l’hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
[0057] Ledit plasmide est notamment sélectionné parmi les plasmides suivants :

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le plasmide, dénommé SARS-S, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3059, le 20 juin 2003,
auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex
15 ; il contient la séquence d’ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement
répertorié sous le n° 031589, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 25348 (SEQ
ID NO : 4), en référence à la séquence Genbank AY274119.3,
le plasmide, dénommé SARS-S1, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3020, le 12 mai 2003,
auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex
15 ; il contient un fragment 5’ de la séquence d’ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue
du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, lequel fragment correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 23454 (SEQ ID NO :5), en référence à la séquence Genbank AY274119.3 Tor2,
le plasmide, dénommé SARS-S2, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3019, le 12 mai 2003,
auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex
15 ; il contient un fragment 3’de la séquence d’ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue
du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, lequel fragment correspondant aux nucléotides des positions 23322 à 25348 (SEQ ID NO :6), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3,
le plasmide, dénommé SARS-SE, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3126, le, 13 novembre
2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris
Cedex 15; il contient l’ADNc correspondant à la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant l’ORF-E de
la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle
région correspondant aux nucléotides des positions 25110 à 26244 (SEQ ID NO :8), en référence à la séquence
Genbank n° d’accès AY274119.3,
le plasmide, dénommé SARS-E, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3046, le 28 mai 2003,
auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex
15 ; il contient la séquence d’ADNc codant pour la protéine E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement
répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des
positions 26082 à 26413 (SEQ ID NO :15), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3,
le plasmide, dénommé SARS-M ; compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3047, le 28 mai 2003,
auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex
15 ; il contient la séquence d’ADNc codant pour la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement
répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus ; laquelle séquence correspondant aux nucléotides des
positions 26330 à 27098 (SEQ ID NO :18), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3,
le plasmide dénommé SARS-MN, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3125, le 13 novembre
2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris

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Cedex 15 ; il contient la séquence d’ADNc correspondant à la région située entre l’ORF-M et l’ORF-N de la souche
de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589 et prélevée à Hanoi, telle que définie ci-dessus,
laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26977 à 28218 (SEQ ID NO :20), en référence à
la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3,
le plasmide dénommé SARS-N, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3048, le 5 juin 2003,
auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex
15 ; il contient l’ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous
le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 28054 à
29430 (SEQ ID NO :38), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3 ; ainsi ce plasmide comprend
un insert de séquence SEQ ID NO :38 et est compris dans une souche bactérienne qui et qu’il a été déposée sous
le n° I-3048, le 5 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cedex 15,
le plasmide dénommé SARS-5’NC, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I- 3124, le 7 novembre
2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris
Cedex 15 ; il contient l’ADNc correspondant à l’extrémité 5’non codante du génome de la souche de SARS-CoV
issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant
aux nucléotides des positions 1 à 204 (SEQ ID NO :39), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3,
le plasmide dénommé SARS-3’NC, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n° I-3123 le 7 novembre
2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris
Cedex 15. ; il contient la séquence d’ADNc correspondant à l’extrémité 3’non codante du génome de la souche de
SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence
correspondant à celle située entre le nucléotide en position 28933 à 29727 (SEQ ID NO :40), en référence à la
séquence Genbank n° d’accès AY274119.3, se termine par une série de nucléotides a.,
le plasmide d’expression dénommé pIV2.3N, contenant un fragment d’ADNc codant pour une fusion C-terminale
de la protéine N (SEQ ID NO : 37) avec une étiquette polyhistidine,
le plasmide d’expression dénommé pIV2.3SC, contenant un fragment d’ADNc codant pour une fusion C-terminale
du fragment correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID
NO : 3) avec une étiquette polyhistidine,
le plasmide d’expression pIV2.3SL, contenant un fragment d’ADNc codant pour une fusion C-terminale du fragment
correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO : 3) avec
une étiquette polyhistidine,
le plasmide d’expression dénommé pIV2.4N, contenant un fragment d’ADNc codant pour une fusion N-terminale
de la protéine N (SEQ ID NO : 3) avec une étiquette polyhistidine,
le plasmide d’expression dénommé pIV2.4SC ou pIV2.4S1, contenant un insert codant pour une fusion N-terminale
du fragment correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID
NO : 3) avec une étiquette polyhistidine, et
le plasmide d’expression dénommé pIV2.4SL contenant un fragment d’ADNc codant pour une fusion N-terminale
du fragment correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID
NO : 3) avec une étiquette polyhistidine.

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[0058] Selon une disposition avantageuse du plasmide d’expression tel que défini ci-dessus, il est compris dans une
souche bactérienne qui a été déposée sous le n° I- 3117, le 23 octobre 2003, auprès de la Collection Nationale de
Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.
[0059] Selon une autre disposition avantageuse du plasmide d’expression tel que défini ci-dessus, il est compris dans
une souche bactérienne qui a été déposée sous le n° I- 3118, le 23 octobre 2003, auprès de la Collection Nationale de
Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.
[0060] Selon une autre disposition du plasmide d’expression tel que défini ci-dessus, il est compris dans une souche
bactérienne qui a été déposée à la CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 sous les numéros suivants :
a) souche n° I- 3118, déposée le 23 octobre 2003,
b) souche n° I- 3019, déposée le 12 mai 2003,
c) souche n° I- 3020, déposée le 12 mai 2003,
d) souche n°I-3059, déposée le 20 juin 2003,
e) souche n° I-3323, déposée le 22 novembre 2004,
f) souche n° I-3324, déposée le 22 novembre 2004,
g) souche n° I-3326, déposée le 1" décembre 2004,
h) souche n° I-3327, déposée le 1er décembre 2004,
i) souche n° I-3332, déposée le 1" décembre 2004,

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j) souche n° I-3333, déposée le 1" décembre 2004,
k) souche n°I-3334, déposée le 1er décembre 2004,
l) souche n° I-3335, déposée le 1er décembre 2004,
m) souche n° I-3336, déposée le 1er décembre 2004,
n) souche n° I-3337, déposée le 1" décembre 2004,
o) souche n° I-3338, déposée le 2 décembre 2004,
p) souche n° I-3339, déposée le 2 décembre 2004,
q) souche n° I-3340, déposée le 2 décembre 2004,
r) souche n° I-3341, déposée le 2 décembre 2004.

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[0061] Les Inventeurs décrivent également un insérat d’acide nucléique d’origine virale, caractérisé en ce qu’il est
contenu dans l’une quelconque des souches telles que définies ci-dessus en a)-r).
[0062] Les Inventeurs décrivent également un acide nucléique comportant un gène synthétique permettant une expression optimisée de la protéine S dans des cellules eucaryotes, caractérisé en ce qu’il possède la séquence SEQ ID
NO: 140.
[0063] Les Inventeurs décrivent également un vecteur d’expression comportant un acide nucléique comportant un
gène synthétique permettant une expression optimisée de la protéine S, lequel vecteur est contenu dans la souche
bactérienne déposée à la CNCM, le 1er décembre 2004, sous le n°I-3333.
[0064] Selon un mode de réalisation dudit vecteur d’expression, il s’agit d’un vecteur viral, sous forme de particule
virale ou sous forme de génome recombinant.
[0065] Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, il s’agit d’une particule virale recombinante ou
d’un génome viral recombinant susceptible d’être obtenu par transfection d’un plasmide selon les alinéas g), h) et k) à
r) tels que définis ci-dessus, dans un système cellulaire approprié, c’est-à-dire, par exemple, des cellules transfectées
avec un ou plusieurs autres plasmide(s), destinés à trancomplémenter certaines fonctions du virus délétées dans le
vecteur et nécessaires à la formation des particules virales.
[0066] On entend ici par « famille de la protéine S » la protéine S complète, son ectodomaine et des fragments de
cet ectodomaine qui sont de préférence produits dans un système eucaryote.
[0067] Les Inventeurs décrivent également un vecteur lentiviral codant pour un polypeptide de la famille de la protéine
S, telle que définie ci-dessus.
[0068] Les Inventeurs décrivent également un virus rougeole recombinant codant pour un polypeptide de la famille
de la protéine S, telle que définie ci-dessus.
[0069] Les Inventeurs décrivent également un virus vaccine recombinant codant pour un polypeptide de la famille de
la protéine S, telle que définie ci-dessus.
[0070] Les Inventeurs décrivent également l’utilisation d’un vecteur selon les alinéas e) à r) tels que définis ci-dessus,
ou d’un vecteur comportant un gène synthétique de la protéine S, tel que défini ci-dessus, pour la production, en système
eucaryote, de la protéine S du coronavirus associé au SRAS, ou d’un fragment de cette protéine.
[0071] Les Inventeurs décrivent également une méthode de production de la protéine S en système eucaryote, comportant une étape de transfection de cellules eucaryotes en culture par un vecteur choisi parmi les vecteurs contenus
dans les souches bactériennes mentionnées aux alinéas e) à r) ci-dessus ou un vecteur comportant un gène synthétique
permettant une expression optimisée de la protéine S.
[0072] Les Inventeurs décrivent également une banque d’ADNc caractérisée en ce qu’elle comprend des fragments
tels que définis ci-dessus, en particulier des fragments d’amplification ou des fragments de restriction, clonés dans un
vecteur recombinant, notamment un vecteur d’expression (banque d’expression).
[0073] Les Inventeurs décrivent également des cellules, notamment des cellules procaryotes, modifiées par un vecteur
recombinant tel que défini ci-dessus.
[0074] Les Inventeurs décrivent également une cellule eucaryote génétiquement modifiée exprimant une protéine ou
un polypeptide tels que définis ci-après. Bien évidemment, les termes "cellule eucaryote génétiquement modifiée" ne
désignent pas une cellule modifiée par un virus sauvage.
[0075] Selon un mode de réalisation avantageux de ladite cellule, elle est susceptible d’être obtenue par transfection
par l’un quelconque des vecteurs mentionnés aux alinéas k) à n) ci-dessus.
[0076] Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, il s’agit de la cellule FRhK4-Ssol-30, déposée
à la CNCM le 22 novembre 2004, sous le n°I-3325.
[0077] Les vecteurs recombinants tels que définis ci-dessus et les cellules transformées par lesdits vecteurs d’expression sont avantageusement utilisés pour la production des protéines et des peptides correspondants. Les banques
d’expression dérivées desdits vecteurs, ainsi que les cellules transformées par lesdites banques d’expression sont
avantageusement utilisées pour identifier les épitopes immunogènes (épitopes B et T) des protéines du coronavirus
associé au SRAS.
[0078] Les Inventeurs décrivent également des protéines et des peptides purifiées ou isolées, caractérisés en ce qu’ils

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sont codés par le polynucléotide ou l’un de ses fragments tels que définis ci-dessus.
[0079] Selon un mode de réalisation avantageux, ladite protéine est sélectionnée dans le groupe constitué par :

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la protéine S de séquence SEQ ID NO :3 ou son ectodomaine
la protéine E de séquence SEQ ID NO :14
la protéine M de séquence SEQ ID NO :17
la protéine N de séquence SEQ ID NO : 37
les protéines codées par les ORFs : ORF1a, ORF1b, ORF3, ORF4 et ORF7 à ORF11, ORF 13 et ORF 14 de
séquence respectivement, SEQ ID NO :74, 75, 10, 12, 22, 24, 26, 28, 30, 33 et 35.

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[0080] On utilisera ci-après indifféremment les termes « ectodomaine de la protéine S » et « forme soluble de la
protéine S ».
[0081] Selon un mode de réalisation avantageux, ledit polypeptide est constitué des acides aminés correspondant
aux positions 1 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S
[0082] Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par :
a) les peptides correspondant aux positions 14 à 1193 et 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S,
b) les peptides correspondant aux positions 2 à 14 (SEQ ID NO : 69) et 100 à 221 de la séquence en acides aminés
de la protéine M ; ces peptides correspondent respectivement à l’ectodomaine et à l’endodomaine de la protéine M, et
c) les peptides correspondant aux positions 1 à 12 (SEQ ID NO : 70) et 53 à 76 (SEQ ID NO : 71) de la séquence
en acides aminés de la protéine E ; ces peptides correspondent respectivement à l’ectodomaine et à l’extrémité Cterminale de la protéine E, et
d) les peptides de 5 à 50 acides aminés consécutifs, de préférence de 10 à 30 acides aminés, inclus ou chevauchant
partiellement ou totalement la séquence des peptides tels que définis en a), b) ou c).

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[0083] Les Inventeurs décrivent également un peptide caractérisé en ce qu’il présente une séquence de 7 à 50 acides
aminés incluant un résidu d’acide aminé sélectionné dans le groupe constitué par :

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l’alanine située en position 2552 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l’ORF1a.
la sérine située en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de la souche de SARS-CoV telle
que définie ci-dessus,
la glycine en position 11 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l’ORF3 de la souche de SARSCoV telle que définie ci-dessus,
la sérine en position 154 de la séquence en acides aminés de la protéine M de la souche de SARS-CoV telle que
définie ci-dessus.

[0084] Les Inventeurs décrivent également un anticorps ou un fragment d’anticorps polyclonal ou monoclonal, susceptible d’être obtenu par immunisation d’un animal avec un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, une banque
d’ADNc telle que définie ci-dessus ou bien une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu’il
se lie avec l’une au moins des protéines codées par le SARS-CoV telles que définies ci-dessus.
[0085] Les Inventeurs décrivent des anticorps polyclonaux, des anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques
tels que les anticorps humanisés, ainsi que leurs fragments (Fab, Fv, scFv).
[0086] Les Inventeurs décrivent également un hybridome produisant un anticorps monoclonal contre la protéine N,
caractérisé en ce qu’il est choisi parmi les hybridomes suivants :

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l’hybridome produisant l’anticorps monoclonal 87, déposé à la CNCM le 1er décembre 2004 sous le numéro I-3328,
l’hybridome produisant l’anticorps monoclonal 86, déposé à la CNCM le 1er décembre 2004 sous le numéro I-3329,
l’hybridome produisant l’anticorps monoclonal 57, déposé à la CNCM le 1er décembre 2004 sous le numéro I-3330, et
l’hybridome produisant l’anticorps monoclonal 156, déposé à la CNCM le 1er décembre 2004 sous le numéro I-3331.

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[0087] Les Inventeurs décrivent également un anticorps ou fragment d’anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé
contre la protéine N, caractérisé en ce qu’il est produit par un hybridome tel que défini ci-dessus.
[0088] On entend par anticorps chimérique, relativement à un anticorps d’une espèce animale particulière ou d’une
classe particulière d’anticorps, un anticorps comprenant tout ou partie d’une chaîne lourde et/ou d’une chaîne légère
d’un anticorps d’une autre espèce animale ou d’une autre classe d’anticorps.
[0089] On entend par anticorps humanisé une immmunoglobuline humaine dans laquelle les résidus des CDRs (Complementary-Determining Regions) qui forment le site de liaison à l’antigène sont remplacés par ceux d’un anticorps
monoclonal non-humain possédant la spécificité, l’affinité ou l’activité recherchées. Par comparaison avec les anticorps

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non-humains, les anticorps humanisés sont moins immunogènes et possèdent une demi-vie prolongée chez l’Homme
car ils ne possèdent qu’une faible proportion de séquences non-humaines étant donné que la quasi-totalité des résidus
des régions FR (Framework) et de la région constante (Fc) de ces anticorps sont ceux d’une séquence consensus
d’immunoglobulines humaines.
[0090] Les Inventeurs décrivent également une puce ou filtre à protéine, caractérisé en ce qu’il comprend une protéine,
un peptide ou bien un anticorps tels que définis ci-dessus.
[0091] Les puces à protéine sont préparées par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Parmi les supports
appropriés sur lesquels peuvent être immobilisés des protéines, on peut citer ceux en matière plastique ou en verre,
notamment sous la forme de microplaques.
[0092] La présente invention a également pour objet des réactifs dérivés de la souche isolée de coronavirus associé
au SRAS, issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, utiles pour l’étude et le diagnostic de l’infection provoquée
par un coronavirus associé au SRAS, lesquels réactifs sont sélectionnés dans le groupe constitué par une souche isolée
de coronavirus et un polynucléotide tels que définis ci-dessus.
[0093] Les Inventeurs décrivent également des réactifs dérivés de la souche isolée de coronavirus associé au SRAS,
issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, utiles pour l’étude et le diagnostic de l’infection provoquée par un
coronavirus associé au SRAS, lesquels réactifs sont sélectionnés dans le groupe constitué par :
(a) une paire d’amorces, une sonde ou une puce à ADN telles que définies ci-dessus,
(b) un vecteur recombinant ou une cellule modifiée tels que définis ci-dessus,
(c) une protéine ou un peptide tel que défini ci-dessus,
(d) un anticorps ou fragment d’anticorps tels que définis ci-dessus, et
(e) une puce à protéine telle que définie ci-dessus.
[0094] Ces différents réactifs sont préparés et utilisés selon les techniques classiques de biologie moléculaire et
d’immunologie, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology
(Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA), dans Current Protocols in Immunology
(John E. Cologan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA) et dans Antibodies : A Laboratory Manual (E.
Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
[0095] Les fragments d’acide nucléique selon l’invention sont préparés et utilisés selon les techniques classiques
telles que définies ci-dessus. Les peptides et les protéines sont préparés par les techniques d’ADN recombinant, connues
de l’Homme du métier, notamment à l’aide des vecteurs recombinants tels que définis ci-dessus. Alternativement, les
peptides peuvent être préparés par les techniques classiques de synthèse en phase solide ou liquide, connues de
l’Homme du métier.
[0096] Les anticorps polyclonaux sont préparés par immunisation d’un animal approprié avec une protéine ou un
peptide tels que définis ci-dessus, éventuellement couplé à la KLH ou à l’albumine et/ou associé à un adjuvant approprié
tel que l’adjuvant de Freund (complet ou incomplet) ou l’hydroxyde d’alumine ; après obtention d’un titre en anticorps
satisfaisant, les anticorps sont récoltés par prélèvement du sérum des animaux immunisés et enrichis en IgG par
précipitation, selon les techniques classiques, puis les IgG spécifiques des protéines du SARS-CoV sont éventuellement
purifiées par chromatographie d’affinité sur une colonne appropriée sur laquelle sont fixés ledit peptide ou ladite protéine,
tels que définis ci-dessus, de façon à obtenir une préparation d’IgG monospécifiques.
[0097] Les anticorps monoclonaux sont produits à partir d’hybridomes obtenus par fusion de lymphocytes B d’un
animal immunisé par une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus avec des myélomes, selon la technique de
Köhler et Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) ; les hybridomes sont cultivés in vitro, notamment dans des fermenteurs
ou produits in vivo, sous forme d’ascite ; alternativement lesdits anticorps monoclonaux sont produits par génie génétique
comme décrit dans le brevet américain US 4,816,567.
[0098] Les anticorps humanisés sont produits par des méthodes générales comme celles décrites dans la Demande
Internationale WO 98/45332.
[0099] Les fragments d’anticorps sont produits à partir des régions VH et VL clonées, à partir des ARNm d’hybridomes
ou de lymphocytes spléniques d’une souris immunisée ; par exemple, les fragments Fv, scFv ou Fab sont exprimés à
la surface de phages filamenteux selon la technique de Winter et Milstein (Nature, 1991, 349, 293-299) ; après plusieurs
étapes de sélection, les fragments d’anticorps spécifiques de l’antigène sont isolés et exprimés dans un système d’expression approprié, par les techniques classiques de clonage et d’expression d’ADN recombinant.
[0100] Les anticorps ou leur fragments tels que définis ci-dessus, sont purifiés par les techniques classiques connues
de l’Homme du métier, telles que la chromatographie d’affinité.
[0101] La présente invention a en outre pour objet l’utilisation d’un produit sélectionné dans le groupe constitué par :
une souche isolée de coronavirus et un polynucléotide tels que définis ci-dessus, pour la préparation d’un réactif de
détection et éventuellement de génotypage/sérotypage, d’un coronavirus associé au SRAS,
[0102] Les Inventeurs décrivent en outre l’utilisation d’un produit sélectionné dans le groupe constitué par : une paire

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d’amorces, une sonde, une puce à ADN, un vecteur recombinant, une cellule modifiée, une protéine ou un peptide, un
anticorps ou un fragment d’anticorps et une puce à protéine tels que définis ci-dessus, pour la préparation d’un réactif
de détection et éventuellement de génotypage/sérotypage, d’un coronavirus associé au SRAS.
[0103] Les protéines et les peptides, qui sont aptes à être reconnus et/ou à induire la production d’anticorps spécifiques
du coronavirus associé au SRAS, sont utiles pour le diagnostic de l’infection par un tel coronavirus ; l’infection est
détectée, par une technique appropriée- notamment EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence-, à partir d’un échantillon
biologique prélevé chez un individu susceptible d’être infecté.
[0104] Selon une disposition avantageuse de ladite utilisation, lesdites protéines sont sélectionnées dans le groupe
constitué par les protéines S, E, M et/ou N et les peptides tels que définis ci-dessus.
[0105] Les protéines S, E, M et/ou N et les peptides dérivés de ces protéines tels que définis ci-dessus, par exemple
la protéine N, sont utilisées pour le diagnostic indirect d’une infection à coronavirus associé au SRAS (diagnostic
sérologique ; détection d’anticorps spécifiques du SARS-CoV), notamment par une méthode immunoenzymatique (ELISA).
[0106] Les anticorps et les fragments d’anticorps tels que définis ci-dessus, notamment ceux dirigés contre les protéines S, E, M et/ou N et les peptides dérivés tels que définis ci-dessus, sont utiles pour le diagnostic direct d’une infection
à coronavirus associé au SRAS ; la détection de protéine(s) du SARS-CoV est réalisée par une technique appropriée,
notamment EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence à partir d’un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d’être infecté.
[0107] Les Inventeurs décrivent également une méthode de détection d’un coronavirus associé au SRAS, à partir
d’un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu’elle comprend au moins :

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(a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un anticorps ou un fragment d’anticorps, une
protéine, un peptide ou bien une puce ou un filtre à protéine ou à peptide tels que définis ci-dessus, et
(b) la révélation par tout moyen approprié des complexes antigène-anticorps formés en (a), par exemple par EIA,
ELISA, RIA, ou par immunofluorescence.

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[0108]

(a1) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un premier anticorps ou un fragment d’anticorps
qui est fixé sur un support approprié, notamment une microplaque,
(a2) le lavage de la phase solide, et
(a3) l’addition d’au moins un second anticorps ou un fragment d’anticorps, différent du premier, ledit anticorps ou
fragment d’anticorps étant éventuellement marqué de façon appropriée.

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35

[0109] Ce procédé qui permet de capturer les particules virales présentes dans l’échantillon biologique est également
dénommé procédé d’immunocapture.
[0110] Par exemple :
-

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-

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Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé l’étape (a) comprend :

l’étape (a1) est réalisée avec au moins un premier anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment de ceux-ci,
dirigé contre la protéine S, M, et/ou E, et/ou un peptide correspondant à l’ectodomaine de l’une de ces protéines
(peptides M2-14 ou E1-12)
l’étape (a3) est réalisée avec au moins un anticorps ou un fragment d’anticorps dirigé contre un autre épitope de la
même protéine ou de préférence contre une autre protéine, de manière préférée contre une protéine interne telle
que la nucléoprotéine N ou l’endodomaine de la protéine E ou M, de manière encore plus préférée il s’agit d’anticorps
ou de fragments d’anticorps dirigés contre la protéine N qui est très abondante dans la particule virale ; lorsqu’un
anticorps ou un fragment d’anticorps dirigé contre une protéine interne (N) ou contre l’endodomaine des protéines
E ou M est utilisé, le dit anticorps est incubé en présence de détergent, comme le Tween 20 par exemple, à des
concentrations de l’ordre de 0,1 %.
l’étape (b) de révélation des complexes antigène-anticorps formés est réalisée, soit directement à l’aide d’un second
anticorps marqué par exemple avec de la biotine ou une enzyme appropriée telle que la peroxydase ou la phosphatase alcaline, soit indirectement à l’aide d’un sérum anti-immunoglobulines marqué comme ci-dessus. Les complexes ainsi formés sont révélés à l’aide d’un substrat approprié.

[0111] Selon une mise en oeuvre préférée de cet aspect de l’invention, l’échantillon biologique est mélangé à l’anticorps
monoclonal de révélation préàlablement à sa mise en contact avec les anticorps monoclonaux de capture. Le cas
échéant, le mélange sérum-anticorps de révélation est incubé pendant au moins 10 minutes à température ambiante
avant d’être appliqué sur la plaque.
[0112] La présente invention a également pour objet un test d’immunocapture destiné à détecter une infection par le

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coronavirus associé au SRAS par détection de la nucléoprotéine native (protéine N), en particulier caractérisé en ce
que l’anticorps utilisé pour la capture de la nucléoprotéine virale native est un anticorps monoclonal spécifique de la
région centrale et/ou d’un épitope conformationnel.
[0113] Selon un mode de réalisation dudit test, l’anticorps utilisé pour la capture de la protéine N est l’anticorps
monoclonal Acm87, produit par l’hybridome déposé à la CNCM le 1er décembre 2004 sous le numéro I-3328.
[0114] Selon un autre mode de réalisation dudit test d’immunocapture, l’anticorps utilisé pour la capture de la protéine
N est l’anticorps monoclonal Acm86, produit par l’hybridome déposé à la CNCM le 1er décembre 2004 sous le numéro
I-3329.
[0115] Selon un autre mode de réalisation dudit test d’immunocapture, les anticorps monoclonaux Acm86 et Acm87
sont utilisés pour la capture de la protéine N.
[0116] Dans les tests d’immunocapture selon l’invention, on peut utiliser pour la révélation de la protéine N, l’anticorps
monoclonal Acm57, produit par l’hybridome déposé à la CNCM le 1er décembre 2004 sous le numéro I-3330, ledit
anticorps étant conjugué à une molécule ou une particule révélatrice.
[0117] Conformément audit test d’immunocapture, une combinaison des anticorps Acm57 et Acm87, conjugués à
une molécule ou une particule révélatrice, est utilisée pour la révélation de la protéine N.
[0118] Une molécule révélatrice peut être un atome radioactif, un colorant, une molécule fluorescente, un fluorophore,
une enzyme ; une particule révélatrice peut être, par exemple : de l’or colloïdal, une particule magnétique ou une bille
de latex.
[0119] La présente invention a également pour objet un réactif de détection d’un coronavirus associé au SRAS,
caractérisé en ce qu’il est sélectionné dans le groupe constitué par une souche isolée de coronavirus telle que définie
ci-dessus et un polynucléotide tel que défini ci-dessus.
[0120] Les Inventeurs décrivent également un réactif de détection d’un coronavirus associé au SRAS, caractérisé en
ce qu’il est sélectionné dans le groupe constitué par :
(a) une paire d’amorces ou une sonde telles que définies ci-dessus,
(b) un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus ou une cellule modifiée telle que définie ci-dessus,
(c) un anticorps ou un fragment d’anticorps tel que défini ci-dessus,
(d) une combinaison d’anticorps comprenant les anticorps monoclonaux Acm86 et/ou Acm87, et l’anticorps monoclonal Acm57, telle que définie ci-dessus,
(e) une puce ou un filtre tels que définis ci-dessus.
[0121] Les Inventeurs décrivent également une méthode de détection d’une infection par un coronavirus associé au
SRAS, à partir d’un échantillon biologique, par ELISA IgG indirect utilisant la protéine N, laquelle méthode est caractérisée
en ce que les plaques sont sensibilisées par une solution de protéine N à une concentration comprise entre 0,5 et
4Pg/mL, de préférence 2Pg/mL, dans un tampon PBS 10mM pH 7,2, rouge de phénol à 0,25mL /L.
[0122] Les Inventeurs décrivent, en outre, une méthode de détection d’une infection par un coronavirus associé au
SRAS, à partir d’un échantillon biologique, par ELISA double épitope, caractérisée en ce que le sérum à tester est
mélangé à l’antigène de révélation, ledit mélange étant ensuite mis au contact de l’antigène fixé sur un support solide.
[0123] Selon une variante des tests de détection des coronavirus associé au SRAS, ces tests combinent un ELSA
utilisant la protéine N, et un autre ELSA utilisant la protéine S, tel que décrit plus bas.
[0124] Les Inventeurs décrivent aussi un complexe immun formé d’un anticorps ou d’un fragment d’anticorps polyclonal
ou monoclonal tel que défini ci-dessus, et d’une protéine ou d’un peptide du coronavirus associé au SRAS.
[0125] La présent invention a en outre pour objet un kit de détection d’un coronavirus associé au SRAS, caractérisé
en ce qu’il comprend au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par une souche isolée de coronavirus et
un polynucléotide.
[0126] Les Inventeurs décriventa en outre un kit de détection d’un coronavirus associé au SRAS, caractérisé en ce
qu’il comprend au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par : une paire d’amorces, une sonde, une puce
à ADN ou à ARN, un vecteur recombinant, une cellule modifiée, une protéine ou un peptide, un anticorps, et une puce
à protéine tels que définis ci-dessus.
[0127] Les Inventeurs décrivent en outre, une composition immunogène, caractérisée en ce qu’elle comprend au
moins un produit sélectionné dans le groupe constitué par :
a) une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus,
b) un polynucléotide de type ADN ou ARN ou l’un de ses fragments représentatifs tels que définis ci-dessus, de
séquence choisie parmi :
(i) la séquence SEQ ID NO : 1 ou son équivalent ARN
(ii) la séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence SEQ ID NO : 1,

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(iii) la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO : 1 ou de la séquence hybridant dans des conditions
de forte stringence avec la séquence SEQ ID NO : 1,
(iv) la séquence nucléotidique d’un fragment représentatif du polynucléotide tel que défini en (i), (ii) ou (iii),
(v) la séquence telle que définie en (i), (ii), (iii) ou (iv), modifiée, et
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c) un vecteur d’expression recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini en b), et
d) une banque d’ADNc telle que définie ci-dessus,

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ladite composition immunogène étant capable d’induire une immunité humorale ou cellulaire protectrice spécifique du
coronavirus associé au SRAS, notamment la production d’un anticorps dirigé contre un épitope spécifique du coronavirus
associé au SRAS.
[0128] Les protéines et les peptides tels que définis ci-dessus, notamment les protéines S, M, E et/ou N et les peptides
dérivés, ainsi que les molécules d’acide nucléique (ADN ou ARN) codant lesdites protéines ou lesdits peptides, sont de
bons candidats vaccin et peuvent être utilisées dans des compositions immunogènes pour la production d’un vaccin
contre le coronavirus associé au SRAS.
[0129] Selon un mode de réalisation avantageux des compositions définies ci-dessus, elles contiennent en outre, au
moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement des substances porteuses et/ou des adjuvants.
[0130] Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.
[0131] Les adjuvants sont avantageusement choisis dans le groupe constitué par des émulsions huileuses, de la
saponine, des substances minérales, des extraits bactériens, de l’hydroxyde d’alumine et le squalène.
[0132] Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par des liposomes
unilamellaires, des liposomes multilamellaires, des micelles de saponine ou des microsphères solides de nature saccharidique ou aurifère.
[0133] Les compositions telles que définies ci-dessus, sont administrées par voie générale, notamment intramusculaire
ou sous-cutanée ou bien par voie locale notamment nasale (aérosol).
[0134] Les Inventeurs décrivent également l’utilisation d’une protéine ou d’un peptide isolé ou purifié présentant une
séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30,
33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75 pour former un complexe immun avec un anticorps dirigé spécifiquement contre un
épitope du coronavirus associé au SRAS.
[0135] Les Inventeurs décrivent également un complexe immun formé d’une protéine ou d’un peptide isolé ou purifié
présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 3, 10, 12, 14, 17, 22,
24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75, et d’un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus
associé au SRAS.
[0136] Les Inventeurs décrivent également l’utilisation d’une protéine ou d’un peptide isolé ou purifié présentant une
séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30,
33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75 pour induire la production d’un anticorps capable de reconnaître spécifiquement un
épitope du coronavirus associé au SRAS.
[0137] Les Inventeurs décrivent également l’utilisation d’un polynucléotide isolé ou purifié présentant une séquence
sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 4, 7, 8, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 31, 36 et 38
pour induire la production d’un anticorps dirigé contre la protéine codée par ledit polynucléotide et capable de reconnaître
spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS
[0138] Les Inventeurs décrivent également des anticorps monoclonaux reconnaissant la protéine S native d’un coronavirus associé au SRAS.
[0139] Les Inventeurs décrivent également l’utilisation d’une protéine ou d’un polypeptide de la famille de la protéine
S, telle que définie ci-dessus, ou d’un anticorps reconnaissant la protéine S native, tel que défini ci-dessus, pour détecter
une infection par un coronavirus associé au SRAS, à partir d’un échantillon biologique.
[0140] Les Inventeurs décrivent également une méthode de détection d’une infection par un coronavirus associé au
SRAS, à partir d’un échantillon biologique, caractérisée en ce que la détection est effectuée par ELISA utilisant la protéine
S recombinante, exprimée dans un système eucaryote.
[0141] Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, il s’agit d’une méthode par ELISA double
épitope, et le sérum à tester est mélangé à l’antigène de révélation, ledit mélange étant ensuite mis au contact de
l’antigène fixé sur un support solide.
[0142] Les Inventeurs décrivent aussi un complexe immun formé d’un anticorps ou d’un fragment d’anticorps monoclonal reconnaissant la protéine S native, et d’une protéine ou d’un peptide du coronavirus associé au SRAS.
[0143] Les Inventeurs décrivent également un complexe immun formé d’une protéine ou d’un polypeptide de la famille
de la protéine S, telle que définie ci-dessus, et d’un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus
associé au SRAS.

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[0144] Les Inventeurs décrivent en outre un kit ou coffret de détection d’un coronavirus associé au SRAS, caractérisé
en ce qu’il comprend au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par : une protéine ou polypeptide de la
famille de la protéine S, telle que définie ci-dessus, un acide nucléique codant pour une protéine ou polypeptide de la
famille de la protéine S, telle que définie ci-dessus, une cellule exprimant une protéine ou polypeptide de la famille de
la protéine S, telle que définie ci-dessus, ou un anticorps reconnaissant la protéine S native d’un coronavirus associé
au SRAS.
[0145] Les Inventeurs décrivent une composition immunogène et/ou vaccinale, caractérisée en ce qu’elle comprend
un polypeptide ou une protéine recombinante de la famille de la protéine S, telle que définie ci-dessus, obtenu dans un
système d’expression eucaryote.
[0146] Les Inventeurs décrivent également une composition immunogène et/ou vaccinale, caractérisée en ce qu’elle
comprend un vecteur ou virus recombinant, exprimant une protéine ou un polypeptide de la famille de la protéine S,
telle que définie ci-dessus.
[0147] Outre les dispositions qui précèdent, l’invention comprend encore d’autres dispositions, qui ressortiront de la
description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du polynucléotide représentant le génome
de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589, et des fragments d’ADNc dérivés
objets de la présente invention, ainsi qu’au Tableau I présentant la liste des séquences :
Tableau I : Liste des séquences

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numéro d’identification

Séquence

Position de l’ADNc en
référence à Genbank
AY274119.3

Numéro de dépôt à la
CNCM du plasmide
correspondant

SEQ ID NO : 1

génome de la souche
issue du prélèvement
031589

-

-

SEQ ID NO : 2

ORF-S*

21406-25348

-

SEQ ID NO : 3

Protéine S

-

-

SEQ ID NO : 4

ORF-S**

21406-25348

I-3059

SEQ ID NO : 5

fragment Sa

21406-23454

I-3020

SEQ ID NO : 6

fragment Sb

23322-25348

I-3019

SEQ ID NO : 7

ORF-3+ORF-4*

25110-26244

-

SEQ ID NO : 8

ORF-3+ORF-4**

25110-26244

I-3126

SEQ ID NO : 9

ORF3

-

-

SEQ ID NO : 10

Protéine ORF-3

-

-

SEQ ID NO : 11

ORF4

-

-

SEQ ID NO : 12

Protéine ORF-4

-

-

SEQ ID NO : 13

ORF-E*

26082-26413

-

SEQ ID NO : 14

Protéine E

-

-

SEQ ID NO : 15

ORF-E**

26082-26413

I-3046

SEQ ID NO : 16

ORF-M*

26330-27098

-

SEQ ID NO : 17

Protéine M

-

-

SEQ ID NO : 18

ORF-M**

26330-27098

I-3047

SEQ ID NO : 19

ORF7 à 11*

26977-28218

-

SEQ ID NO : 20

ORF7 à 11**

26977-28218

1-3125

SEQ ID NO : 21

ORF7

-

-

SEQ ID NO : 22

Protéine ORF7

-

-

SEQ ID NO : 23

ORF8

-

-

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EP 1 694 829 B1
(suite)
numéro d’identification

Séquence

Position de l’ADNc en
référence à Genbank
AY274119.3

Numéro de dépôt à la
CNCM du plasmide
correspondant

SEQ ID NO : 24

Protéine ORF8

-

-

SEQ ID NO : 25

ORF9

-

-

SEQ ID NO : 26

Protéine ORF9

-

-

SEQ ID NO : 27

ORF10

-

-

SEQ ID NO : 28

Protéine ORF10

-

-

SEQ ID NO : 29

ORF11

-

-

SEQ ID NO : 30

Protéine ORF11

-

-

SEQ ID NO: 31

OrF1ab

265-21485

-

SEQ ID NO : 32

ORF13

28130-28426

-

SEQ ID NO : 33

Protéine ORF13

-

-

SEQ ID NO : 34

ORF14

-

-

SEQ ID NO : 35

Protéine ORF14

28583-28795

-

SEQ ID NO : 36

ORF-N*

28054-29430

SEQ ID NO : 37

Protéine N

-

-

SEQ ID NO : 38

ORF-N**

28054-29430

I-3048

SEQ ID NO : 39

5’non-codante**

1-204

I-3124

SEQ ID NO : 40

3’non-codante**

28933-29727

I-3123

SEQ ID NO : 41

ORF1ab
Fragment L0

30-500

SEQ ID NO : 42

Fragment L1

211-2260

-

SEQ ID NO : 43

Fragment L2

2136-4187

-

SEQ ID NO : 44

Fragment L3

3892-5344

-

SEQ ID NO : 45

Fragment L4b

4932-6043

-

SEQ ID NO : 46

Fragment L4

5305-7318

-

SEQ ID NO : 47

Fragment L5

7275-9176

-

SEQ ID NO : 48

Fragment L6

9032-11086

-

SEQ ID NO : 49

Fragment L7

10298-12982

-

SEQ ID NO : 50

Fragment L8

12815-14854

-

SEQ ID NO : 51

Fragment L9

14745-16646

-

SEQ ID NO : 52

Fragment L10

16514-18590

-

SEQ ID NO : 53

Fragment L11

18500-20602

-

SEQ ID NO : 54

Fragment L12

20319-22224

-

SEQ ID NO : 55

Amorce N sens

-

-

SEQ ID NO : 56

Amorce N antisens

-

-

SEQ ID NO : 57

Amorce SC sens

-

-

SEQ ID NO : 58

Amorce SL sens

-

-

SEQ ID NO : 59

Amorce SC e t SL antisens

-

-

5

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30

35

40

45

50

55

-

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EP 1 694 829 B1
(suite)
numéro d’identification

Séquence

Position de l’ADNc en
référence à Genbank
AY274119.3

Numéro de dépôt à la
CNCM du plasmide
correspondant

SEQ ID NO : 60

Amorce sens série 1

28507-28522

-

SEQ ID NO : 61

Amorce antisens série 1

28774-28759

SEQ ID NO : 62

Amorce sens série 2

28375-28390

-

SEQ ID NO : 63

Amorce antisens série 2

28702-28687

-

SEQ ID NO : 64

Sonde 1/série 1

28561-28586

-

SEQ ID NO : 65

Sonde 2/série 1

28588-28608

-

SEQ ID NO : 66

Sonde 1/série 2

28541-28563

-

SEQ ID NO : 67

Sonde 2/série 2

28565-28589

-

SEQ ID NO : 68

Amorce ancre 14T

SEQ ID NO : 69

Peptide M2-14

-

-

SEQ ID NO : 70

Peptide E1-12

-

-

SEQ ID NO : 71

Peptide E53-76

-

-

SEQ ID NO : 72

5’non-codante*

1-204

-

SEQ ID NO: 73

3’non-codante*

28933-29727

-

SEQ ID NO : 74

Protéine ORF1a

-

-

SEQ ID NO : 75

Protéine ORF1b

-

-

SEQ ID NO:76-139

Amorces

SEQ ID NO:140

Pseudogène de S

SEQ ID NO:141-148

amorces

SEQ ID NO:149

Aa1-13 de S

SEQ ID NO:150

polypeptide

SEQ ID NO:151-158

amorces

5

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20

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30

35

40

* produit d’amplification PCR (amplicon)
** insert cloné dans le plasmide déposé à la CNCM
ainsi qu’aux dessins annexés dans lesquels :

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50

-

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-

la figure 1 illustre l’analyse par Western-blot de l’expression in vitro des protéines recombinantes N, SC et SL à partir
des vecteurs d’expression pIVEX. Piste 1 : pIV2.3N. Piste 2 : pIV2.3SC. Piste 3 : pIV2.3SL. Piste 4 : pIV2.4N. Piste
5 : pIV2.4S1 ou pIV2.4SC. Piste 6 : pIV2.4SL. L’expression de la protéine GFP exprimée à partir du même vecteur
est utilisée comme contrôle.
la figure 2 illustre l’analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE)
et coloration au bleu de Coomassie, de l’expression in vivo de la protéine N à partir des vecteurs d’expression
pIVEX. La souche d’E.coli BL21(DE3)pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants est cultivée à 30°C
dans du milieu LB, en présence ou en l’absence d’inducteur (IPTG 1mM). Piste 1 : pIV2.3N Piste 2 : pIV2.4N.
la figure 3 illustre l’analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE)
et coloration au bleu de Coomassie, de l’expression in vivo des polypeptides SL et SC à partir des vecteurs d’expression pIVEX. La souche d’E.coli BL21(DE3)pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants est cultivée

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à 30°C dans du milieu LB, en présence ou en l’absence d’inducteur (IPTG 1mM). Piste 1 : pIV2.3SC Piste 2 :
pIV2.3SL. Piste 3 : pIV2.4S1 Piste 4 : pIV2.4SL.
la figure 4 illustre l’activité antigénique des protéines N, SL et SC recombinantes produites dans la souche E. coli
BL21(DE3)pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants. A : électrophorèse (SDS-PAGE) des lysats
bactériens. B et C : Westem-blot avec les sérums, provenant d’un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés
respectivement 8 jours (B : sérum M12) et 29 jours-(C : sérum M13) après le début des symptômes du SRAS. Piste
1 : pIV2.3N. Piste 2 : pIV2.4N. Piste 3 : pIV2.3SC. Piste 4 : pIV2.4 S1. Piste 5 : pIV2.3SL. Piste 6 : pIV2.4SL
la figure 5 illustre la purification sur colonne Ni-NTA agarose de la protéine N recombinante produite dans la souche
E. coli BL21(DE3)pDIA17 à partir du vecteur pIV2.3N. Piste 1 : Extrait bactérien total. Piste 2 : Extrait soluble. Piste
3 : Extrait insoluble. Piste 4 : Extrait déposé sur la colonne Ni-NTA. Piste 5 : protéines non-retenues. Piste 6 :
Fractions du pic 1. Piste 7 : Fractions du pic 2.
la figure 6 illustre la purification de la protéine SC recombinante à partir des corps d’inclusions produits dans la
souche E. coli BL21(DE3)pDIA17 transformée par le pIV2.4S1.A. Traitement au Triton X-100 (2%) : Piste 1 : Extrait
bactérien total. Piste 2 : Extrait soluble. Piste 3 : Extrait insoluble. Piste 4 : Surnageant après traitement au Triton
X-100 (2 %). Pistes 5 et 6 : Culot après traitement au Triton X-100 (2 %).B : Traitement à l’urée 4M, 5M, 6M et 7M
des extraits solubles et insolubles.
la figure 7 représente l’immunoempreinte réalisée à l’aide d’un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV et d’un
sérum de patient atteint de pneumopathie atypique.
la figure 8 représente des immunoempreintes réalisées à l’aide d’un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV
et d’immunsérums de lapins spécifiques de la nucléoprotéine N (A) et de la protéine de spicule S (B). I.S. : sérum
immun. p.i. : sérum pré-immun. L’immunsérum anti-N a été utilisé au 1/50000 et l’immunsérum anti-S au 1/10000.
la figure 9 illustre la réactivité en ELISA des sérums polyclonaux monospécifiques de lapin dirigés contre la protéine
N ou le fragment court de la protéine S (SC), vis-à-vis des protéines recombinantes correspondantes utilisées pour
l’immunisation. A : lapins P13097, P13081, et P13031 immunisés avec la protéine N recombinante purifié. B : lapins
P11135, P13042, et P14001 immunisés avec une préparation de corps d’inclusions correspondants au fragment
court de la protéine S (SC). I.S. : sérum immun. p.i. : sérum pré-immun.
la figure 10 illustre la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante purifiée, vis-à-vis de sérum de patients
atteints de pneumonie atypique causée par le SARS-CoV. Figure 10a : plaques ELISA préparés avec la protéine
N à la concentration de 4 Pg/ml et 2 Pg/ml. Figure 10b : plaque ELISA préparée avec la protéine N à la concentration
de 1 Pg/ml. Les sérums désignés A, B, D, E, F, G, H correspondent à ceux du Tableau IV.
la figure 11 illustre l’amplification par RT-PCR de quantités décroissantes d’ARN synthétique du gène N du SARSCoV (107 à 1 copie), à l’aide des couples d’amorces n° 1 (N/+/28507,N/-/28774) (A) et n° 2 (N/+/28375,N/-/28702)
(B). T : amplification réalisée en l’absence d’ARN. MW : marqueur d’ADN.
la figure 12 illustre l’amplification par RT-PCR en temps réel d’ARN synthétique du gène N du SARS-CoV : des
quantités décroissantes d’ARN synthétique en répliquat (repli. ; pistes 16 à 29) ainsi que de l’ARN viral dilué au
1/20x10-4 (piste 32) ont été amplifiés par RT-PCR en temps réel à l’aide du kit "Light Cycler RNA Amplification Kit
Hybridization Probes" et des couples d’amorces et de sondes de la série n° 2, dans les conditions décrites à l’exemple
8.
la figure 13.1 à 13.70 (figure 13.1 à 13.70) représente la carte de restriction de la séquence SEQ ID NO : 1 correspondant à l’équivalent ADN du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro
031589.
la figure 14 montre le résultat du test de sérologie SRAS par ELISA N indirect (1ère série de sérums testés)
la figure 15 montre le résultat du test de sérologie SRAS par ELISA N indirect (2ème série de sérums testés)
la figure 16 présente le résultat du test de sérologie SRAS par ELISA N double épitope (1 ère série de sérums testés)
la figure 17 montre le résultat du test de sérologie SRAS par ELISA N double épitope (2ème série de sérums testés)
la figure 18 illustre le test de réactivité des anticorps monoclonaux anti-N par ELISA sur la nucléoprotéine N native
du SRAS-CoV. Les anticorps ont été testés sous la forme de surnageants de culture d’hybridomes par un ELISA
indirect utilisant un lysat irradié de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme antigène (courbes lysat
SRAS). Un contrôle négatif de réactivité est réalisé pour chaque anticorps sur un lysat de cellules VeroE6 non
infectées (courbes lysat négatif). Plusieurs anticorps monoclonaux de spécificité connue ont été utilisés comme
anticorps témoins négatifs : para1-3 dirigé contre les antigènes des virus parainfluenza de type 1-3 (Bio-Rad) et
grippe B dirigé contre les antigènes du virus de la grippe de type B (Bio-Rad).
la figure 19 illustre le test de réactivité des anticorps monoclonaux anti-N du SRAS-CoV par ELISA sur les antigènes
natifs du coronavirus humain 229E (HCoV-229E). Les anticorps ont été testés sous la forme de surnageants de
culture d’hybridomes par un test ELISA indirect utilisant un lysat de cellules MRC-5 infectées par le coronavirus
humain 229E comme antigène (courbes lysat 229E). Un contrôle négatif d’immunoréactivité est réalisé pour chaque
anticorps sur un lysat de cellules MRC-5 non infectées (courbes lysat négatif). L’anticorps monoclonal 5-11H.6
dirigé contre la protéine S du coronavirus humain 229E (Sizun et al. 1998, J. Virol. Met. 72 : 145-152) est utilisé

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-

15

comme anticorps témoin positif. Les anticorps paral-3 dirigé contre les antigènes des virus parainfluenza de type
1-3 (Bio-Rad) et grippe B dirigé contre les antigènes du virus de la grippe de type B (Bio-Rad) ont été ajoutés au
panel des anticorps monoclonaux testés.
la figure 20 montre un test de réactivité des anticorps monoclonaux anti-N du SRAS-CoV par western blot sur la
nucléoprotéine N native du SRAS-CoV dénaturée. Un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV a été
préparé dans le tampon de dépôt selon Laemmli et mis à migrer dans un gel SDS à 12% de polyacrylamide puis
les protéines ont été transférées sur membrane de PVDF. Les anticorps monoclonaux anti-N testés ont été utilisés
pour l’immunoessai à la concentration de 0.05 Pg/ml. La révélation est faite avec des anticorps anti-IgG(H+L) de
souris couplés à la peroxydase (NA93IV, Amersham) et le système ECL+. Deux anticorps monoclonaux ont été
utilisés comme témoins négatifs de réactivité : grippe B dirigé contre les antigènes du virus de la grippe de type B
(Bio-Rad) et para1-3 dirigé contre les antigènes des virus parainfluenza de type 1-3 (Bio-Rad).
la figure 21 présente les plasmides d’expression en cellules de mammifères de la protéine S du SRAS-CoV. Le
cDNA de la S du SRAS-CoV a été inséré entre les sites BamH1 et Xho1 du plasmide d’expression pcDNA3.1(+)
(Clontech) pour obtenir le plasmide pcDNA-S et entre les sites Nhe1 et Xho1 du plasmide d’expression pCI (Promega)
pour obtenir le plasmide pCI-S. Les séquences WPRE et CTE ont été insérées dans chacun des deux plasmides
pcDNA-S et pCI-S entre les sites Xho1 et Xba1 pour obtenir respectivement les plasmides pcDNA-S-CTE, pcDNAS-WPRE, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE.
SP : peptide signal prédit (aa 1-13) avec le logiciel signalP v2.0 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering, 10 : 1-6)
TM : région transmembranaire prédite (aa 1196-1218) avec le logiciel TMHMM v2.0 (Sonnhammer et al., 1998,
Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182, AAAI Press). Il faut noter que
les acides aminés W1194 et P1195 font possiblement partie de la région transmembranaire avec des probabilités
respectives de 0,13 et 0,42
P-CMV : promoteur immédiat/précoce du cytomégalovirus. BGH pA : signal de polyadénylation du gène de
l’hormone de croissance bovine
SV40 late pA : signal de polyadénylation tardif du virus SV40
SD/SA : sites donneur et accepteur d’épissage
WPRE : séquences du "Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element" du virus de l’hépatite
de la marmotte
CTE : séquences du "constitutive transport element" du rétrovirus simien de Mason-Pfizer

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-

35

la figure 22 illustre l’expression de la protéine S après transfection de cellules VeroE6. Des extraits cellulaires ont
été préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6 par les plasmides pcDNA, pcDNA-S, pCI et pCI-S.
Des extraits cellulaires ont également été préparés 18 heures après infection par le virus recombinant de la vaccine
VV-TF7.3 et transfection par les plasmides pcDNA ou pcDNA-S. A titre de contrôle, des extraits de cellules VeroE6
ont été préparés 8 heures après infection par le SRAS-CoV à une multiplicité d’infection de 3. Ils ont été séparés
sur un gel SDS à 8% d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et
d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham). Une échelle de
masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.

40

SRAS-CoV : extrait de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV
Mock : extrait contrôle de cellules non infectées
45

la figure 23 illustre l’effet des séquences CTE et WPRE sur l’expression de la protéine S après transfection de
cellules VeroE6 et 293T. Des extraits cellulaires ont été préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6
(A) ou 293T (B) par les plasmides pcDNA, pcDNA-S, pcDNA-S-CTE, pcDNA-S-WPRE, pCI-S, pCI-S-CTE et pCIS-WPRE, séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal
de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham).
Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.

50

SRAS-CoV : extrait de cellules VeroE6 préparés 8 heures après infection par le SRAS-CoV à une multiplicité
d’infection de 3.
Mock : extrait contrôle de cellules VeroE6 non infectées
55

-

la figure 24 présente des vecteurs lentiviraux défectifs à DNA flap central pour l’expression de la S du SRAS-CoV.
Le cADN de la protéine S du SRAS-CoV a été cloné sous la forme d’un fragment BamH1-Xho1 dans le plasmide
pTRIP∆U3-CMV contenant un vecteur lentiviral défectif TRIP à DNA flap central (Sirven et al, 2001, Mol. Ther., 3 :
438-448) pour obtenir le plasmide pTRIP-S. Les cassettes d’expression optimales constituées du promoteur immé-

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diat/précoce du virus CMV, d’un signal d’épissage, du cDNA de la S et de l’un ou l’autre des signaux post-transcriptionnels CTE ou WPRE ont été substituées à la cassette EF1α-EGFP du vecteur d’expression lentiviral défectif à
DNA FLAP central TRIP∆U3-EF1 α (Sirven et al, 2001, Mol. Ther., 3 :438-448) pour obtenir les plasmides pTRIPSD/SA-S-CTE et pTRIP-SD/SA-S-WPRE.
5

SP : peptide signal
TM : région transmembranaire
P-CMV : promoteur immédiat/précoce du cytomégalovirus
P-EF1α : promoteur du gène EF1α
SD/SA : sites donneur et accepteur d’épissage
WPRE : séquences du "Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element" du virus de l’hépatite
de la marmotte
CTE : séquences du "constitutive transport element" du rétrovirus simien de Mason-Pfizer
LTR : « Long terminal repeat »
∆U3 : LTR délété des séquences « promoter/enhancer »
cPPT : « polypurine tract cis-active sequence »
CTS : « central termination sequence »

10

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20

la figure 25 montre l’analyse par western blot de l’expression de la S du SRAS-CoV par des lignées cellulaires
transduites par les vecteurs lentiviraux TRIP-SD/SA-S-WPRE et TRIP-SD/SA-S-CTE. Des extraits cellulaires ont
été préparés à partir de lignées FrhK4-S-CTE et FrhK4-S-WPRE établies après transduction par les vecteurs
lentiviraux TRIP-SD/SA-S-CTE et TRIP-SD /SA-S-WPRE respectivement. Ils ont été séparés sur un gel SDS à 8%
d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un conjugué antiIgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase. Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.

25

T- : extrait contrôle de cellules FrhK-4
T+ : extrait de cellules FrhK-4 préparées 24h après infection par le SRAS-CoV à une multiplicité d’infection de 3.
30

35

-

la figure 26 concerne l’analyse de l’expression de polypeptide Ssol par des lignées cellulaires transduites par les
vecteurs lentiviraux TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE et TRIP-SD/SA-Ssol-CTE. La sécrétion du polypeptide Ssol a été
recherchée dans le surnageant d’une série de clones cellulaires isolés après transduction de cellules FRhK-4 par
les vecteurs lentiviraux TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE et TRIP-SD/SA-Ssol-CTE. 5 Pl de surnageant dilués au 1/2 dans
du tampon de dépôt selon Laemmli ont été analysés par western blot révélé par un anticorps monoclonal anti-FLAG
(M2, Sigma) et un conjugué anti-IgG(H+L) de souris couplé à la peroxidase. T- : surnageant de la lignée FRhK-4
parentale. T+ : surnageant de cellules BHK infectées par un virus recombinant de la vaccine exprimant le polypeptide
Ssol. La flèche pleine indique le polypeptide Ssol, tandis que la flèche creuse indique une réaction croisée avec
une protéine d’origine cellulaire.
la figure 27 montre les résultats relatifs à l’analyse du polypeptide Ssol purifié
A. 8, 2, 0.5 et 0.125 Pg de polypeptide recombinant Ssol purifié par chromatographie d’affinité anti-FLAG et
gel filtration (G75) ont été séparés sur gel SDS à 8% de polyacrylamide. Le polypeptide Ssol ainsi que des
quantités variables de marqueurs de masse moléculaire (MM) ont été révélés par coloration au nitrate d’argent
(Gelcode SilverSNAP stain kit II, Pierce).
B. Marqueurs étalons pour l’analyse par spectrométrie de masse SELDI-TOF

40

45

IgG : IgG bovine de MM 147300
ConA : conalbumine de MM 77490
HRP : péroxidase de raifort analysée à titre de contrôle et de MM 43240
C. Analyse par spectrométrie de masse (SELDI-TOF) du polypeptide recombinant Ssol.

50

Les pics A et B correspondent au polypeptide Ssol simplement et doublement chargé.
D. Séquençage de l’extrémité N-terminale du polypeptide recombinant Ssol. 5 cycles de dégradation d’Edman
en phase liquide ont été réalisés sur un séquenceur ABI494 (Applied Biosystems).

55

-

la figure 28 illustre l’influence d’un signal d’épissage et des séquences CTE et WPRE sur l’efficacité de l’immunisation
génique à l’aide d’ADN plasmidique codant la S du SRAS-CoV

20

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A.Des groupes de 7 souris BALB/c ont été immunisés à deux reprises à 4 semaines d’intervalle à l’aide de 50
Pg d’ADN plasmidique de pCI, pcDNA-S, pCI-S, pcDNA-N et pCI-HA.
B. Des groupes de 6 souris BALB/c ont été immunisés à deux reprises à 4 semaines d’intervalle à l’aide de 2
Pg, 10Pg ou 50 Pg d’ADN plasmidique de pCI, pCI-S, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE.
5

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A. Groupes de souris BALB/c immunisés à deux reprises à 4 semaines d’intervalle à l’aide de 50 Pg d’ADN
plasmidique de pCI, pcDNA-S, pCI-S, pcDNA-N et pCI-HA. K : sérum préimmun. ■ : sérum immun.
B. Groupes de souris BALB/c immunisés à deux reprises à 4 semaines d’intervalle à l’aide de 2 Pg, 10Pg ou
50 Pg d’ADN plasmidique de pCI, pCI-S, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE.

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Les sérums immuns prélevés 3 semaines après la deuxième immunisation ont été analysés par ELISA indirect en
utilisant un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme antigène. Les titres en anticorps anti-SRASCoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO spécifique de 0,5 après révélation par un
anticorps polyclonal anti-IgG de souris couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) et du TMB (KPL).
la figure 29 montre la séroneutralisation de l’infectivité du SRAS-CoV par les anticorps induits chez la souris après
immunisation génique à l’aide d’ADN plasmidique codant la S du SRAS-CoV. Des pools de sérums immuns prélevés
3 semaines après la deuxième immunisation ont été réalisés pour chacun des groupes des expériences décrites
dans la figure 28 et évalués pour leur capacité à séroneutraliser l’infectivité de 100 TCID50 du SRAS-CoV sur
cellules FRhK-4. 4 points sont réalisés pour chacune des dilutions de raison 2 testées à partir du 1/20. Le titre
séroneutralisant est calculé selon la méthode de Reed et Munsch comme l’inverse de la dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4.

la figure 30 illustre l’immunoréactivité du polypeptide recombinant Ssol vis à vis de sérums de patients atteints de
SRAS. La réactivité de sérums de patients a été analysée par test ELISA indirect contre des phases solides préparées
à l’aide du polypeptide recombinant Ssol purifié. Les anticorps de patients réagissant avec la phase solide à une
dilution de 1/400 sont révélés par un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) humain couplé à la peroxidase (Amersham
NA933V) et du TMB plus H2O2 (KPL). Les sérums de cas probables de SRAS sont identifiés par un numéro d’ordre
du Centre National de Référence des Virus Influenzae ainsi que par les initiales du patient et le nombre de jours
écoulés depuis le début des symptômes, le cas échéant. Les sérums TV sont des sérums témoins de sujets qui
ont été prélevés en France avant l’épidémie de SRAS survenue en 2003.
La figure 31 montre l’induction d’anticorps dirigés contre le SRAS-CoV après immunisation avec le polypeptide
recombinant Ssol. Deux groupe de 6 souris ont été immunisés à 3 semaines d’intervalle avec 10 Pg de polypeptide
recombinant Ssol (groupe Ssol) adjuvé avec de l’hydroxyde d’aluminium ou, à titre de contrôle, de l’adjuvant seul
(groupe mock).Trois immunisations successives ont été réalisées et les sérums immuns ont été prélevés 3 semaines
après chacune des trois immunisations (IS1, IS2, IS3). Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun
des 2 groupes par ELISA indirect en utilisant un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme
antigène. Les titres en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO
spécifique de 0,5 après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG de souris couplé à la peroxidase (Amersham)
et du TMB (KPL).
La figure 32 présente l’alignement nucléotidique des séquences du gène synthétique 040530 avec la séquence du
gène sauvage de l’isolat 031589 du SRAS-CoV. I-3059 correspond aux nucléotides 21406-25348 de l’isolat 031589
du SRAS-CoV déposé à la C.N.C.M. sous le numéro I-3059 (SEQ ID NO : 4, plasmide pSRAS-S). S-040530 est la
séquence du gène synthétique 040530.
la figure 33 illustre l’utilisation d’un gène synthétique pour l’expression de la S du SRAS-CoV. Des extraits cellulaires
préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6 (A) ou 293T (B) par les plasmides pCI, pCI-S, pCI-S-CTE,
pCI-S-WPRE et pCI-Ssynth ont été séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide
d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase
(NA934V, Amersham). Le western blot est révélé par luminescence (ECL+, Amersham) et acquisition sur un dispositif
d’imagerie numérique (FluorS, BioRad). Les niveaux d’expression de la protéine S ont été mesurés en quantifiant
les 2 bandes majoritaires repérées sur l’image.
la figure 34 présente un schéma de la construction des virus vaccine recombinants VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TNS et VV-TN-Ssol
A. Les cDNA de la protéine S et du polypeptide Ssol du SRAS-CoV ont été inséré entre les sites BamH1 et
Sma1 du plasmide de transfert pTG186 pour obtenir les plasmides pTG-S et pTG-Ssol.
B. Les séquences du promoteur synthétique 480 ont ensuite été substituées à celles du promoteur 7.5 par
échange du fragment Nde1-Pst1 des plasmides pTG186poly, pTG-S et pTG-Ssol pour obtenir les plasmides
de transfert pTN480, pTN-S et pTN -Ssol.

21

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C. Séquence du promoteur synthétique 480 tel que contenu entre les sites Nde1 et Pst1 des plasmides de
transfert de la série pTN. Un site Asc1 a été inséré pour faciliter les manipulations ultérieures. Les sites de
restriction ainsi que la séquence du promoteur sont soulignés
D. Les virus recombinants de la vaccine sont obtenus par double recombinaison homologue in vivo entre la
cassette TK des plasmides de transfert des séries pTG et pTN et le gène TK de la souche Copenhague du
virus de la vaccine.

5

SP : peptide signal prédit (aa 1-13) avec le logiciel signalP v2.0 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering,
10 : 1-6)
TM : région transmembranaire prédite (aa 1196-1218) avec le logiciel TMHMM v2.0 (Sonnhammer et al.,
1998, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182, AAAI Press). Il faut
noter que les acides aminés W1194 et P1195 font possiblement partie de la région transmembranaire avec
des probabilités respectives de 0,13 et 0,42.
TK-L, TK-R : parties gauche et droite du gène de la thymidine kinase du virus de la vaccine
MCS : site multiple de clonage
PE : promoteur précoce
PL : promoteur tardif
PL synth : promoteur tardif synthétique 480

10

15

20

-

25

la figure 35 illustre l’expression de la protéine S par les virus vaccine recombinants, analysée par western blot. Des
extraits cellulaires ont été préparés 18 heures après infection de cellules CV1 par les virus vaccine recombinants
VV-TG, VV-TG-S et VV-TN-S à une M.O.I. de 2 (A). A titre de contrôle, des extraits de cellules VeroE6 ont été
préparés 8 heures après infection par le SRAS-CoV à une multiplicité d’infection de 2. Des extraits cellulaires ont
également été préparés 18 heures après infection de cellules CV1 par les virus vaccine recombinants VV-TG-S,
VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S et VV-TN-Ssol (B). Ils ont été séparés sur des gels SDS à 8% d’acrylamide et
analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L)
de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham). « 1Pl » et « 10Pl » indique les quantités d’extraits cellulaires
déposées sur le gel. Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
SRAS-CoV : extrait de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV
Mock : extrait contrôle de cellules non infectées

30

-

la figure 36 montre le résultat d’une analyse par western blot de la sécrétion du polypeptide Ssol par les virus vaccine
recombinants.

35

A. Des surnageants de cellules CV1 infectées par le virus vaccine recombinant VV-TN, différents clones du
virus VV-TN-Ssol et par les virus VV-TG-Ssol ou VV-TN-Sflag ont été récoltés 18 heures après infection de
cellules CV1 à une M.O.I. de 2.
B. Des surnageants de cellules 293T, FRhK-4, BHK-21 et CV1 infectées en dupliqués (1,2) par le virus vaccine
recombinant VV-TN-Ssol à une M .O.I. de 2 ont été récoltés 18 heures après infection. Le surnageant de cellules
CV1 infectées par le virus VV-TN a également été récolté à titre de contrôle (M).

40

45

50

55

Tous les surnageants ont été séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide selon Laemmli et analysés par western
blot à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris anti-FLAG et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de souris
couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) (A) ou à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps
polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham) (B).
Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
la figure 37 montre l’analyse du polypeptide Ssol, purifié par gel SDS de polyacrylamide
10, 5 et 2 Pl de polypeptide recombinant Ssol purifié par chromatographie d’affinité anti-FLAG ont été séparés sur
gel SDS en gradient de 4 à 15 % de polyacrylamide. Le polypeptide Ssol ainsi que des quantités variables de
marqueurs de masse moléculaire (MM) ont été révélés par coloration au nitrate d’argent (Gelcode SilverSNAP stain
kit II, Pierce).
la figure 38 illustre l’immunoréactivité du polypeptide recombinant Ssol produit par le virus vaccine recombinant VVTN-Ssol vis-à-vis de sérums de patients atteints de SRAS. La réactivité de sérums de patients a été analysée par
test ELISA indirect contre des phases solides préparées à l’aide du polypeptide recombinant Ssol purifié. Les
anticorps de patients réagissant avec la phase solide à une dilution de 1/100 et 1/400 sont révélés par un anticorps
polyclonal anti-IgG(H+L) humain couplé à la peroxidase (Amersham NA933V) et du TMB plus H2O2 (KPL). Les

22

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5

-

A. Des pools de sérums immuns prélevés 3 semaines après chacune des deux immunisations ont été réalisés
pour chacun des groupes et ont été analysés par ELISA indirect en utilisant un lysat de cellules VeroE6 infectées
par le SRAS-CoV comme antigène. Les titres en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de
la dilution produisant une DO spécifique de 0,5 après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG de souris
couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) et du TMB (KPL).
B. Les pools de sérums immuns ont été évalués pour leur capacité à séroneutraliser l’infectivité de 100 TCID50
du SRAS-CoV sur cellules FRhK-4. 4 points sont réalisés pour chacune des dilutions de raison 2 testées à
partir du 1/20. Le titre séroneutralisant est calculé selon la méthode de Reed et Munsch comme l’inverse de la
dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4.

10

15

20

-

la figure 40 décrit la construction des virus recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol.
A. Le vecteur rougeole est un génome complet de la souche vaccinale Schwarz du virus de la rougeole (MV)
dans lequel une unité de transcription supplémentaire a été introduite (Combredet, 2003, Journal of Virology,
77 : 11546-11554). L’expression des phases ouvertes de lecture (ORF) supplémentaires est contrôlée par les
éléments agissant en cis nécessaires à la transcription, à la formation de la coiffe et à la polyadénylation du
transgène, qui ont été copiés des éléments présents à la jonction N/P. 2 vecteurs différents permettent l’insertion
entre les gènes P (phosphoprotéine) et M (matrice) d’une part et H (hémagglutinine) et L (polymérase) d’autre
part.
B. Les génomes recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol du virus de la rougeole ont été
construits par l’insertion des ORFs de la protéine S et du polypeptide Ssol au sein d’une unité de transcription
supplémentaire localisée entre les gènes P et M du vecteur.

25

30

Les différents gènes du virus de la rougeole (MV) sont indiqués : N (nucléoprotéine), PVC (phosphoprotéine
et protéine V/C), M (matrice), F (fusion), H (hémagglutinine), L (polymérase). T7 = promoteur de l’ARN
polymérase T7, hh = ribozyme hammerhead, T7t = séquence terminatrice de l’ARN polymérase du phage
T7, ∂ = ribozyme du virus de l’hépatite ∂, (2), (3) = unités de transcription supplémentaires (ATU).
Taille du génome du MV : 15894 nt.
SP : peptide signal
TM : région transmembranaire
FLAG : étiquette FLAG

35

40

-

la figure 41 illustre l’expression de la protéine S par les virus rougeole recombinants, analysée par western blot.
Des extraits cytoplasmiques ont été préparés après infection de cellules Vero par différents passages des virus
MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol et le virus sauvage MWSchw à titre de contrôle. Des extraits
cellulaires en tampon de dépôt selon Laemmli ont également été préparés 8 heures après infection de cellules
VeroE6 par le SRAS-CoV à une multiplicité d’infection de 3. Ils ont été séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide
et analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal antiIgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham).
Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
Pn : nième passage du virus après coculture de cellules 293-3-46 et Vero.
SRAS-CoV : extrait de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV
Mock : extrait contrôle de cellules VeroE6 non infectées

45

50

55

sérums de cas probables de SRAS sont identifiés par un numéro d’ordre du Centre National de Référence des
Virus Influenzae ainsi que par les initiales du patient et le nombre de jours écoulés depuis le début des symptômes,
le cas échéant. Les sérums TV sont des sérums témoins de sujets qui ont été prélevés en France avant l’épidémie
de SRAS survenue en 2003.
la figure 39 montre la réponse en anticorps anti-SRAS-CoV chez la souris après immunisation par les virus vaccine
recombinants. Des groupes de 7 souris BALB/c ont été immunisés par voie i.v. à deux reprises à 4 semaines
d’intervalle par 106 u.f.p. de virus vaccine recombinants VV-TG, VV-TG-HA, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VVTN-S, VV-TN-Ssol.

-

la figure 42 montre l’expression de la protéine S par les virus rougeole recombinants, analysée par immunofluorescence
Des cellules Vero en monocouches sur lamelles de verre ont été infectées par le virus sauvage MWSchw (A) ou
les virus MVSchw2-SARS-S (B) et MVSchw2-SARS-Ssol (C). Quand les syncytia ont atteint 30 à 40% de confluence

23

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5

(A., B.) ou 90-100% (C), les cellules ont été fixées, perméabilisées et marquées par des anticorps polyclonaux de
lapins anti-SRAS-CoV et un conjugué anti-IgG(H+L) de lapin couplé au FITC (Jackson).
la figure 43 illustre l’analyse par western blot de l’immunoréactivité de sérums de lapins dirigés contre les peptides
E1-12, E53-76 et M2-14. Le lapin 20047 a été immunisé avec le peptide E1-12 couplé à la KLH. Les lapins 22234
et 22240 ont été immunisés avec le peptide E53-76 couplé à la KLH. Les lapins 20013 et 20080 ont été immunisés
avec le peptide M2-14 couplé à la KLH. Les immunsérums ont été analysés par western blot à l’aide d’extraits de
cellules infectées par le SRAS-CoV (B) ou à l’aide d’extraits de cellules infectées par un virus recombinant de la
vaccine exprimant la protéine E (A) ou M (C) de l’isolat 031589 du SRAS-CoV. Les immunoempreintes ont été
révélées à l’aide d’un conjugué anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham).

10

[0148] La position des protéines E etM est indiquée par une flèche.
[0149] Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
[0150] Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d’illustration de l’objet de
l’invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
15

Exemple 1 : Clonage et séquençage du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié
sous le numéro 031589

20

25

30

35

[0151] L’ARN de la souche de SARS-CoV a été extrait à partir du prélèvement de lavage bronchoalvéolaire répertorié
sous le numéro 031589, effectué sur un patient de l’hôpital français de Hanoi (Vietnam) atteint de SRAS.
[0152] L’ARN isolé a été utilisé comme matrice pour amplifier les ADNc correspondant aux différents cadres ouverts
de lecture du génome (ORF la, ORF1b, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N (incluant les ORF-13 et ORF-14), ORF3, ORF4,
ORF7 à ORF11), et aux extrémités 5’ et 3’ non-codantes. Les séquences des amorces et des sondes utilisées pour
l’amplification/détection ont été définies d’après la séquence nucléotidique disponible du SARS-CoV.
[0153] Dans ce qui suit les amorces et les sondes sont identifiées par : la lettre S, suivie d’une lettre qui indique la
région correspondante du génome (L pour l’extrémité 5’incluant ORF1a et ORF1b ; S, M et N pour les ORF-S, ORF-M,
ORF-N, SE et MN pour les régions intergéniques correspondantes), puis éventuellement de Fn, Rn, avec n inclus entre
1 et 6 correspondant aux amorces utilisées pour la PCR nichée ou imbriquée (paire F1 + R1 pour la première amplification,
paire F2 + R2 pour la deuxième amplification, etc...), puis de /+/ ou /-/ correspondant à une amorce sens ou antisens
et enfin des positions des amorces en référence à la séquence Genbank AY27411.3 ; pour les amorces S et N sens et
antisens et les autres amorces sens uniquement, lorsqu’une seule position est indiquée elle correspond à celle de
l’extrémité 5’ d’une sonde ou d’une amorce d’environ 20 bases ; pour les amorces antisens autres que les amorces S
et N, lorsqu’une seule position est indiquée elle correspond à celle de l’extrémité 3’ d’une sonde ou d’une amorce
d’environ 20 bases.
[0154] Les produits d’amplifications ainsi générés ont été séquencés à l’aide d’amorces spécifiques afin de déterminer
la séquence complète du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589.
Ces produits d’amplification, à l’exception de ceux correspondant aux ORF1a et ORF1b, ont ensuite été clonés dans
des vecteurs d’expression afin de produire les protéines virales correspondantes et les anticorps dirigés contre ces
protéines, notamment par immunisation à base d’ADN.

40

1. Extraction des ARN

45

50

[0155] Les ARN ont été extraits à l’aide du kit QIamp viral RNA extraction mini (QIAGEN) en suivant les recommandations du fabricant. De manière plus précise : 140 Pl du prélèvement et 560 Pl de tampon AVL ont été mélangés
vigoureusement pendant 15 secondes, incubés 10 min à température ambiante puis centrifugés brièvement à vitesse
maximale. 560 Pl d’éthanol à 100% ont été ajoutés au surnageant et le mélange ainsi obtenu a été agité très vigoureusement pendant 15 sec. 630 Pl du mélange ont ensuite été déposés sur la colonne.
[0156] La colonne a été placée sur un tube de 2 ml, centrifugée 1 min à 8000 rpm, puis le reste du mélange précédent
a été déposé sur la même colonne, centrifugé à nouveau, 1 min à 8000 rpm et la colonne a été transférée sur un tube
de 2 ml propre. Ensuite, 500 Pl de tampon AW1 ont été ajoutés sur la colonne, puis la colonne a été centrifugée 1 min
à 8000 rpm et l’éluat a été éliminé. 500 Pl de tampon AW2 ont été ajoutés sur la colonne qui a ensuite été centrifugée
3 min à 14000 rpm et transférée sur un tube de 1,5 ml. Enfin, 60 Pl de tampon AVE ont été ajoutés sur la colonne qui
a été incubée 1 à 2 min à température ambiante puis centrifugée 1 min à 8000 rpm. L’éluat correspondant à l’ARN purifié
a été récupéré et congelé à -20°C.

55

24

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2. Amplification, séquençage et clonage des ADNc
2.1) ADNc codant pour la protéine S
5

10

[0157] Les ARN extraits à partir du prélèvement ont été soumis à une transcription inverse à l’aide d’oligonucléotides
hexamériques de séquence aléatoire (pdN6), afin de produire des fragments d’ADNc.
[0158] La séquence codant pour la glycoprotéine S du SARS-CoV a été amplifiée sous la forme de deux fragments
d’ADN chevauchants : fragment 5’ (SRAS-Sa, SEQ ID NO:5) et fragment 3’(SRAS-Sb, SEQ ID NO:6), en réalisant deux
amplifications successives à l’aide d’amorces imbriquées. Les amplicons ainsi obtenus ont été séquencés, clonés dans
le vecteur plasmidique PCR 2.1-TOPO™ (IN VITROGEN), puis la séquence des ADNc clonés a été déterminée.
a)clonage et séquençage des fragments Sa et Sb

15

a1) synthèse de l’ADNc
[0159] Le mélange réactionnel contenant : ARN (5 Pl) , H2O ppi (3,5 Pl), tampon de transcriptase inverse5X (4 Pl,),
dNTP 5 mM (2 Pl), pdN6 100 ug/ml (4 Pl), RNasin 40 UI/ul (0,5 Pl) et transcriptase inverse AMV-RT, 10 UI/ul, PROMEGA
(1Pl) a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : 45 min à 42°C, 15 min à 55°C, 5 min à 95°C,
puis l’ADNc obtenu a été maintenu à +4°C.

20

a2) première amplification PCR

25

[0160] Les extrémités 5’ et 3’ du gène S ont été amplifiées respectivement avec les paires d’amorces S/Fl/+/
21350-21372 et S/R1/-/ 23518-23498, S/F3/+/ 23258-23277 et S/R3/-/25382-25363. Le mélange réactionnel de 50 Pl
contenant : ADNc (2 Pl), amorces 50 PM (0,5 Pl), tampon 10 X (5 Pl), dNTP 5 mM (2 Pl), Taq Expand High Fidelity,
Roche (0,75 Pl) et H20 (39, 75 Pl) a été amplifié dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes : une étape initiale
de dénaturation à 94°C pendant 2 min a été suivie de 40 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant
30 sec, une étape d’hybridation à 55°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 2 min 30 sec, avec
10 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, puis d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min.

30

a3) deuxième amplification PCR

35

[0161] Les produits de la première amplification PCR (amplicons 5’ et 3’) ont subi une seconde étape d’amplification
PCR (PCR nichée) dans des conditions identiques à celles de la première amplification, avec les paires d’amorces
S/F2/+/21406-21426 et S/R2/-/23454-23435, et S/F4/+/23322-23341 et S/R4/-/25348-25329, respectivement pour l’amplicon 5’ et l’amplicon 3’.
a4) clonage et séguençage des fragments Sa et Sb

40

45

50

55

[0162] Les amplicons Sa (extrémité 5’) et Sb (extrémité 3’) ainsi obtenus ont été purifiés à l’aide du kit QIAquick PCR
purification (QIAGEN), en suivant les recommandations du fabricant, puis ils ont été clonés dans le vecteur PCR2.1TOPO (kit Invitrogen), pour donner les plasmides dénommés SRAS-S1 et SRAS-S2.
[0163] L’ADN des clones Sa et Sb a été isolé puis l’insert correspondant a été séquencé à l’aide du Kit Big Dye,
Applied Biosystem® et des amorces universelles M13 forward et M13 reverse, ainsi que des amorces : S/S/+/21867,
S/S/+/22353, S/S/+/22811, S/S/+/23754, S/S/+/24207, S/S/+/24699, S/S/+/24348, S/S/-/24209, S/S/-/23630, S/S/-/
23038, S/S/-/22454, S/S/-/21815, S/S/-/24784, S/S/+/21556, S/S/+/23130 et S/S/+/24465, en suivant les instructions
du fabricant ; les séquences des fragments Sa et Sb ainsi obtenues correspondent aux séquences SEQ ID NO :5 et
SEQ ID NO :6 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0164] Le plasmide, dénommé SARS-S1 a été déposé sous le n° I-3020, le 12 mai 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient un fragment 5’
de la séquence du gène S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que
définie ci-dessus, lequel fragment dénommé Sa correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 23454 (SEQ ID
NO :5), en référence à la séquence Genbank AY274119.3 Tor2.
[0165] Le plasmide, dénommé TOP10F’-SARS-S2 a été déposé sous le n° I-3019, le 12 mai 2003, auprès de la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient un
fragment 3’de la séquence du gène S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589,
telle que définie ci-dessus, lequel fragment dénommé Sb correspondant aux nucléotides des positions 23322 à 25348
(SEQ ID NO : 6), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.

25

EP 1 694 829 B1
b) clonage et séquençage de l’ADNc complet (clone SRAS-S de 4 kb)
[0166]

L’ADNc S complet a été obtenu à partir des clones SARS-S1 et SARS-S2 précités, de la façon suivante :

1) une réaction d’amplification PCR a été réalisée sur un clone SARS-S2 en présence de l’amorce S/R4/-/
25348-25329 précitée et de l’amorce S/S/+/24696-24715: un amplicon de 633 pb a été obtenu,
2) une autre réaction d’amplification PCR a été réalisée sur un autre clone SARS-S2, en présence des amorces
S/F4/+/23322-23341 précitée et S/S/- /24803-24784: un amplicon de 1481 pb a été obtenu,
La réaction d’amplification a été réalisée dans les conditions telles que définies ci-dessus pour l’amplification des
fragments Sa et Sb, à l’exception que 30 cycles d’amplifications comprenant une étape de dénaturation à 94° C
pendant 20 sec et une étape d’élongation à 72° C pendant 2 min 30 sec ont été effectués.
3) les 2 amplicons (633 pb et 1481 pb) ont été purifiés dans les conditions telles que définies ci-dessus pour les
fragments Sa et Sb.
4) une autre réaction d’amplification PCR à l’aide des amorces S/F4/+/23322-23341 et S/R4/-/25348-25329 précitées, a été réalisée sur les amplicons purifiés obtenus en 3). La réaction d’amplification a été réalisée dans les
conditions telles que définies ci-dessus pour l’amplification des fragments Sa et Sb, à l’exception que 30 cycles
d’amplifications ont été effectués.
L’amplicon de 2026 pb ainsi obtenu a été purifié, cloné dans le vecteur PCR2.1-TOPO puis séquencé comme cidessus, à l’aide des amorces telles que définies ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. Le clone ainsi obtenu a été
dénommé clone 3’.
5) Le clone SARS-S1 précédemment obtenu et le clone 3’ont été digérés par EcoR I, les bandes d’environ 2kb ainsi
obtenues ont été purifiées sur gel puis amplifiées par PCR avec les amorces S/F2/+/21406-21426 et S/R4/-/
25348-25329 précitées. La réaction d’amplification a été réalisée dans les conditions telles que définies ci-dessus
pour l’amplification des fragments Sa et Sb, à l’exception que 30 cycles d’amplifications ont été effectués. L’amplicon
d’environ 4 kb a été purifié et séquencé. Il a ensuite été cloné dans le vecteur PCR2.1-TOPO pour donner le
plasmide, dénommé SARS-S, et l’insert contenu dans ce plasmide a été séquencé comme ci-dessus, à l’aide des
amorces telles que définies ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. Les séquences d’ADNc de l’insert et de l’amplicon
codant pour la protéine S, correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 2 dans la
liste de séquences jointe en annexe, elles codent pour la protéine S (SEQ ID NO : 3).

5

10

15

20

25

30

[0167] La séquence de l’amplicon correspondant à l’ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV
issue du prélèvement n°031589 présente les deux mutations suivantes par rapport aux séquences correspondantes de
respectivement les isolats Tor2 et Urbani, les positions des mutations étant indiquées en référence à la séquence
complète du génome de l’isolat Tor2 (Genbank AY274119.3) :
35

40

g/t en position 23220 ; le codon alanine (gct) en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de
Tor2 est remplacé par un codon sérine (tct),
c/t en position 24872 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine S, et

[0168] Le plasmide, dénommé SARS-S, a été déposé sous le n° I-3059, le 20 juin 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient la séquence
d’ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589,
laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 25348 (SEQ ID NO :4), en référence à la
séquence Genbank AY274119.3.

45

2.2) ADNc codant pour les protéines M et E

50

[0169] Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse,
associée, lors de la même étape (kit Titan One Step RT-PCR®, Roche), à une réaction d’amplification par PCR, à l’aide
des couples d’amorces :
-

55

S/E/F1/+/26051-26070 et S/E/Rl/-/26455-26436 pour amplifier l’ORF-E, et
S/M/F1/+/26225-26244 et S/M/Rl/-/27148-27129 pour amplifier l’ORF-M.

[0170] Un premier mélange réactionnel contenant : 8,6 Pl d’H2Oppi, 1 Pl de dNTP (5mM), 0,2 Pl de chacune des
amorces (50PM), 1,25 Pl de DTT (100mM) et 0,25 Pl de RNAsin (40UI/Pl) a été combiné avec un deuxième mélange
réactionnel contenant : 1 Pl d’ARN, 7 Pl d’H2Oppi, 5 Pl de tampon de RT-PCR 5X et 0,5 Pl de mélange d’enzyme et les
mélanges combinés ont été incubés dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : 30 min à 42°C, 10 min à

26

EP 1 694 829 B1

5

55°C, 2 min à 94°C suivi de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 10 sec, une étape
d’hybridation à 55°C pendant 30 sec et une étape d’élongation à 68°C pendant 45 sec, avec 3 sec d’incrément par cycle
et enfin une étape d’élongation terminale à 68°C pendant 7 min.
[0171] Les produits d’amplification ainsi obtenus (amplicons M et E) ont subi une deuxième amplification PCR (PCR
nichée) en utilisant le kit Expand High-Fi®, Roche), à l’aide des couples d’amorces :
-

10

15

20

25

30

35

40

S/E/F2/+/26082-26101 et S/E/R2/-/26413-26394 pour l’amplicon E, et
S/M/F2/+/26330-26350 et S/M/R2/-/27098-27078 pour l’amplicon M.

[0172] Le mélange réactionnel contenant : 2 Pl du produit de la première PCR, 39,25 Pl d’H2Oppi, 5 Pl de tampon
10X contenant du MgCl2, 2 Pl de dNTP (5mM), 0,5Pl de chacune des amorces (50 PM) et 0,75Pl de mélange d’enzyme
a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : une étape de dénaturation à 94°C pendant 2 min a
été suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 60°C
pendant 30 sec et une étape d’élongation à 72°C pendant 45 sec, avec 3 sec d’incrément par cycle, et enfin une étape
d’élongation terminale à 72°C pendant 7 min. Les produits d’amplification obtenus correspondant aux ADNc codant
pour les protéines E et M ont été séquencés comme ci-dessus, à l’aide des amorces : S/E/F2/+/26082 et S/E/R2/-/
26394, S/M/F2/+/26330, S/M/R2/-/27078 précitées et des amorces S/M/+/26636-26655 et S/M/-/26567-26548. Ils ont
ensuite été clonés, comme ci-dessus, pour donner les plasmides dénommés SARS-E et SARS-M. L’ADN de ces clones
a ensuite été isolé et séquencé à l’aide des amorces universelles M13 forward et M13 reverse ainsi que des amorces
S/M/+/26636 et S/M/-/26548 précitées.
[0173] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc codant pour la protéine E (SEQ ID NO : 13) de la souche de
SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes
des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani. La séquence de la protéine E de la souche de SARS-CoV 031589
correspond à la séquence SEQ ID NO : 14 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0174] Le plasmide, dénommé SARS-E a été déposé sous le n° I-3046, le 28 mai 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient la séquence
d’ADNc codant pour la protéine E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle
que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26082 à 26413 (SEQ ID NO :
15), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
[0175] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc codant pour la M (SEQ ID NO :16) de la souche de SARSCoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par rapport à la séquence correspondante de
l’isolat AY274119.3-Tor2. En revanche, en position 26857, l’isolat AY278741-Urbani comporte un c et la séquence de
la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n°031589 un t. Cette mutation aboutit à une modification
de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante: en position 154, une proline (AY278741-Urbani) est
changée en sérine dans la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n°031589. La séquence de
la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n°031589 correspond à la séquence
SEQ ID NO :17 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0176] Le plasmide, dénommé SARS-M a été déposé sous le n° I-3047, le 28 mai 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient la séquence
d’ADNc codant pour la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle
que définie ci-dessus ; laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26330 à 27098 (SEQ ID NO :
18), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
2.3) ADNc correspondant aux ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11

45

[0177] La même stratégie d’amplification, de clonage et de séquençage a été utilisée pour obtenir les fragments
d’ADNc correspondant respectivement aux ORF suivantes: ORF 3, ORF4, ORF7, ORF8, ORF9, ORF10 et ORF11. Les
couples d’amorces utilisées pour la première amplification sont :
50

-

ORF3 et ORF4 : S/SE/F1/+/25069-25088 et S/SE/R1/-/26300-26281
ORF7 à ORF11 : S/MN/F1/+/26898-26917 et S/MN/R1/-/28287-28266

[0178]
55

-

Les couples d’amorces utilisées pour la deuxième amplification sont :

ORF3 et ORF4 : S/SE/F2/+/25110-25129 et S/SE/R2/-/26244-26225
ORF7 à ORF11 : S/MN/F2/+/26977-26996 et S/MN/R2/-/28218-28199

[0179]

Les conditions de la première amplification (RT-PCR) sont les suivantes : 45 min à 42°C, 10 min à 55°C, 2

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5

10

15

20

25

30

35

40

min à 94°C suivi de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation
à 58°C pendant 30 sec et une étape d’élongation à 68°C pendant 1 min, avec 5 sec d’incrément par cycle et enfin une
étape d’élongation terminale à 68°C pendant 7 min.
Les conditions de la PCR nichée sont les suivantes : une étape de dénaturation à 94°C pendant 2 min a été suivie de
40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, une étape d’hybridation à 58°C pendant 30
sec et une étape d’élongation à 72°C pendant 50 sec, avec 4 sec d’incrément par cycle et enfin une étape d’élongation
terminale à 72°C pendant 7 min.
[0180] Les produits d’amplification obtenus correspondant aux ADNc contenant respectivement les ORF3 et 4 et les
ORF7 à 11 ont été séquencés à l’aide des amorces : S/SE/+/25363, S/SE/+/25835, S/SE/-/25494, S/SE/-/25875, S/MN/
+/27839, S/MN/+/27409, S/MN/-/27836 S/MN/-/27799 et clonés comme ci-dessus pour les autres ORF, pour donner
les plasmides dénommés SARS-SE et SARS-MN. L’ADN de ces clones a été isolé et séquencé à l’aide de ces mêmes
amorces et des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens.
[0181] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc de la région contenant les ORF 3 et 4 (SEQ ID NO :7) de la
souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 comporte une différence nucléotidique par rapport à la séquence
correspondante de l’isolat AY274119-Tor2. Cette mutation en position 25298 aboutit à une modification de la séquence
en acides aminés de la protéine correspondante (ORF 3): en position 11, une arginine (AY274119-Tor2) est changée
en glycine dans la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589. En revanche, aucune mutation n’a été
identifiée par rapport à la séquence correspondante de l’isolat AY278741-Urbani. Les séquences des ORF 3 et 4 la
souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO :10
et 12 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0182] Le plasmide, dénommé SARS-SE a été déposé sous le n° I-3126, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient l’ADNc correspondant à la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant l’ORF-E de la souche de SARS-CoV issue du
prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle région correspondant aux nucléotides
des positions 25110 à 26244 (SEQ ID NO :8), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3,
[0183] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc correspondant à la région contenant les ORF7 à ORF11 (SEQ
ID NO :19) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par rapport
aux séquences correspondantes des isolats AY274119-Tor2 et AY278741-Urbani. Les séquences des ORF7 à 11 de
la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO :
22, 24, 26, 28 et 30 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0184] Le plasmide dénommé SARS-MN a été déposé sous le n° I-3125, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient la séquence
d’ADNc correspondant à la région située entre l’ORF-M et l’ORF-N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement
répertorié sous le n° 031589 et prélevée à Hanoi, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux
nucléotides des positions 26977 à 28218 (SEQ ID NO :20 ), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
[0185] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc correspondant à la région contenant les ORF7 à ORF11 (SEQ
ID NO :19) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par rapport
aux séquences correspondantes des isolats AY274119-Tor2 et AY278741-Urbani. Les séquences des ORF7 à 11 de
la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO :
22, 24, 26, 28 et 30 dans la liste de séquences jointe en annexe.
2.4) ADNc codant pour la protéine N et incluant les ORF13 et ORF14

45

50

55

[0186] L’ADNc a été synthétisé et amplifié comme décrit ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. De manière plus
précise, le mélange réactionnel contenant : 5 Pl d’ARN, 5 Pl d’H2O ppi 4 Pl de tampon de reverse transcriptase 5X, 2
Pl de dNTP (5 mM), 2 Pl d’oligo 20T (5 PM), 0,5 Pl de RNasin (40 UI/ul) et 1, 5 Pl de AMV-RT (10 UI/ul Promega) a été
incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : 45 min à 42°C, 15 min à 55°C, 5 min à 95°C, puis il a été
maintenu à +4°C.
[0187] Une première amplification PCR a été réalisée avec la paire d’amorces S/N/F3/+/28023 et S/N/R3/-/29480.
[0188] Le mélange réactionnel comme ci-dessus pour l’amplification des fragments S1 et S2 a été incubé dans un
thermocycleur, dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min a été suivie de
40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, une étape d’hybridation à 55°C pendant 30
sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 1 min 30 sec avec 10 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle,
puis d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min.
[0189] L’amplicon obtenu à la première amplification PCR a subi une seconde étape d’amplification PCR (PCR nichée)
avec la paires d’amorce S/N/F4/+/28054 et S/N/R4/-/29430 dans des conditions identiques à celles de la première
amplification.
[0190] Le produit d’amplification obtenu correspondant à l’ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-

28

EP 1 694 829 B1

5

10

15

CoV issue du prélèvement n°031589a été séquencé à l’aide des amorces: S/N/F4/+/28054, S/N/R4/-/29430, S/N/+/
28468, S/N/+/28918 et S/N/-/28607 et cloné comme ci-dessus pour les autres ORF, pour donner le plasmide dénommé
SARS-N. L’ADN de ces clones a été isolé et séquencé à l’aide des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens,
ainsi que des amorces S/N/+/28468, S/N/+/28918 et S/N/-/28607.
[0191] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-N et incluant les ORF13 et ORF14
(SEQ ID NO :36) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par
rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani. La séquence de la protéine
N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspond à la séquence SEQ ID NO : 37 dans la liste
de séquences jointe en annexe.
[0192] Les séquences des ORF13 et 14 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspondent
respectivement aux séquences SEQ ID NO : 32 et 34 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0193] Le plasmide dénommé SARS-N a été déposé sous le n° I-3048, le 5 juin 2003, auprès de la Collection Nationale
de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient l’ADNc codant pour la
protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus,
laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 28054 à 29430 (SEQ ID NO :38), en référence à la
séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
2.5) extrémités 5’ et 3’ non-codantes

20

a) extrémité 5’non-codante (5’NC)
a1) synthèse de l’ADNc

25

30

35

40

45

50

55

[0194] Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse
dans les conditions suivantes :
[0195] L’ARN (15 Pl) et l’amorce S/L/-/443 (3 Pl à la concentration de 5Pm, ont été incubés 10 min à 75°C.
[0196] Ensuite, du Tampon de transcriptase inverse 5X (6 Pl, INVITROGEN), des dNTP 10 mM (1 Pl), du DTT 0,1M
(3 Pl) ont été ajoutés et le mélange a été incubé à 50°C pendant 3 min.
[0197] Enfin la transcriptase inverse (3 Pl de Superscript®, INVITROGEN) a été ajoutée au mélange précédent qui
a été incubé à 50°C pendant 1h30 puis à 90 °C pendant 2 min.
[0198] L’ADNc ainsi obtenu a été purifié à l’aide du kit QIAquick PCR purification (QIAGEN), selon les recommandations
du fabricant.
b1) Réaction à la Terminal Transferase (TdT)
[0199] L’ADNc (10 Pl) est incubé 2 min à 100°C, conservé dans la glace, puis sont ajoutés : H20 (2,5 Pl), tampon TdT
5X (4 Pl, AMERSHAM), dATP 5mM (2 Pl) et TdT (1,5 Pl, AMERSHAM). Le mélange ainsi obtenu est incubé 45 min à
37°C puis 2 min à 65°C.
[0200] Le produit obtenu est amplifié par une première réaction PCR à l’aide des amorces : S/L/-/225-206 et ancre
14T : 5’-AGATGAATTCGGTACCTTTTTTTTTTTTTT-3’ (SEQ ID NO :68). Les conditions de l’amplification sont les
suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min est suivie de 10 cycles comprenant une étape de
dénaturation à 94°C pendant 10 sec, une étape d’hybridation à 45°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C
pendant 30 sec puis de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 10 sec, une étape d’hybridation
à 50°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 30 sec, puis d’une étape finale d’élongation à 72°C
pendant 5 min.
[0201] Le produit de la première amplification PCR a subi une seconde étape d’amplification à l’aide des amorces :
S/L/-/204-185 et ancre 14T précitée dans des conditions identiques à celles de la première amplification. L’amplicon
ainsi obtenu a été purifié, séquencé à l’aide de l’amorce S/L/-/182-163 puis il a été cloné comme ci-dessus pour les
différentes ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-5’NC. L’ADN de ce clone a été isolé et séquencé à l’aide
des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens et de l’amorce S/L/-/182-163 précitée.
[0202] L’amplicon représentant l’ADNc correspondant à l’extrémité 5’NC de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO : 72 dans la liste de séquences jointe en
annexe ; cette séquence ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats
AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani.
[0203] Le plasmide dénommé SARS-5’NC a été déposé sous le n° I- 3124, le 7 novembre 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient l’ADNc correspondant à l’extrémité 5’non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le
n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 1 à 204 (SEQ

29

EP 1 694 829 B1
ID NO :39 ), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
b) extrémité 3’non-codante (3’NC)
5

10

15

20

25

30

a1) synthèse de l’ADNc
[0204] Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse,
selon le protocole suivant : le mélange réactionnel contenant : ARN (5 Pl), H2O (5 Pl), tampon de transcriptase inverse
5X (4 Pl), dNTP 5 mM (2 Pl), Oligo 20T 5PM (2 Pl), RNasin 40 U/ Pl (0,5 Pl) et RT-AMV 10 UI/ Pl (1,5 Pl, PROMEGA)
a été incubé dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes : 45 min à 42°C, 15 min à 55°C, 5 min à 95°C, puis
il a été maintenu à +4°C.
[0205] L’ADNc obtenu a été amplifié par une première réaction PCR à l’aide des amorces S/N/+/28468-28487 et
ancre 14T précitée. Les conditions de l’amplification sont les suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C
pendant 2 min est suivie de 10 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, une étape
d’hybridation à 45°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 50 sec puis de 30 cycles comprenant
une étape de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, une étape d’hybridation à 50°C pendant 30 sec puis une étape
d’élongation à 72°C pendant 50 sec, puis d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min.
[0206] Le produit de la première amplification PCR a subi une seconde étape d’amplification à l’aide des amorces
S/N/+/28933-28952 et ancre 14T précitée, dans des conditions identiques à celles de la première amplification. L’amplicon ainsi obtenu a été purifié, séquencé à l’aide de l’amorce S/N/+/29257-29278 et cloné comme ci-dessus pour les
différentes ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-3’NC. L’ADN de ce clone a été isolé et séquencé à l’aide
des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens et de l’amorce S/N/+/29257-29278 précitée.
[0207] L’amplicon représentant l’ADNc correspondant à l’extrémité 3’NC de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO :73 dans la liste de séquences jointe en
annexe ; cette séquence ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats
AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani.
[0208] Le plasmide dénommé SARS-3’NC a été déposé sous le n° I-3123 le 7 novembre 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. ; il contient la séquence
d’ADNc correspondant à l’extrémité 3’non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement
répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant à celle située entre le nucléotide en position 28933 à 29727 (SEQ ID NO :40), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3, se
termine par une série de nucléotides a.
2.6) ORF1a et ORF1b

35

40

[0209] L’amplification de la région 5’ contenant les ORFla et ORFlb du génome du SARS-CoV issu du prélèvement
031589 a été réalisée en pratiquant des réactions de RT-PCR suivies de PCR nichées selon les mêmes principes que
ceux précédemment décrits pour les autres ORF. Les fragments amplifiés sont chevauchants sur plusieurs dizaines de
bases, permettant ainsi la reconstruction informatique de la séquence complète de cette partie du génome. En moyenne,
les fragments amplifiés sont de deux kilobases.
[0210] 14 fragments chevauchants dénommés L0 à L12 ont ainsi été amplifiées à l’aide des amorces suivantes :
Tableau II: Amorces utilisées pour l’amplification de la région 5’(ORF1a et ORF1b)

45

50

55

REGION
AMPLIFIEE ET
SEQUENCEE (ne
tient pas compte
des amorces)

Amorce sens RTPCR

Amorce antisens
RT-PCR

L0 50-480

S/L0/F1/+30

S/L0/R1/-481

L1 231-2240

S/L1/F1/+147

L2 2156-4167

Amorce sens PCR
nichée

Amorce antisens
PCR nichée

S/L1/R1/-2336

S/L1/F2/+211

S/L1/R2/-2241

S/L2/F1/+2033

S/L2/R1/-4192

S/L2/F2/+2136

S/L2/R2/-4168

L3 3913-5324

S/L3bis/F1/+3850

S/L3bis/R1/-5365

S/L3bis/F2/+3892

S/L3bis/R2/-5325

L4b 4952-6023

S/L4b/F1/+4878

S/L4b/R1/-6061

S/L4b/F2/+4932

S/L4b/R2/-6024

L4 5325-7318

S/L4/F1/+5272

S/L4/R1/-7392

S/L4/F2/+5305

S/L4/R2/-7323

30

EP 1 694 829 B1
(suite)

5

10

15

20

Amorce sens RTPCR

Amorce antisens
RT-PCR

Amorce sens PCR
nichée

Amorce antisens
PCR nichée

L5 7296-9156

S/L5/F1/+7111

S/L5/R1/-9253

S/L5/F2/+7275

S/L5/R2/-9157

L6 9053-11066

S/L6/F1/+8975

S/L6/R1/-11151

S/L6/F2/+9032

S/L6/R2/-11067

L7 10928-12962

S/L7/F1/+10883

S/L7/R1/-13050

S/L7/F2/+10928

S/L7/R2/-12963

L8 12835-14834

S/L8/F1/+12690

S/L8/R1/-14857

S/L8/F2/+12815

S/L8/R2/-14835

L9 14765-16624

S/L9/F1/+14688

S/L9/R1/-16678

S/L9/F2/+14745

S/L9/R2/-16625

L10 16534-18570

S/L10/P1/+16451

S/L10/R1/-18594

S/L10/F2/+16514

S/L10/R2/-18571

L11 18521-20582

S/L11/F1/+18441

S/L11/R1/-20612

S/L11/F2/+18500

S/L11/R2/-20583

L12 20338-22205.

S/L12/F1/+20279

S/L12/R1/-22229

S/L12/F2/+20319

S/L12/R2/-22206

[0211] Tous les fragments ont été amplifiés dans les conditions suivantes, excepté le fragment L0 qui a été amplifié
comme décrit ci-dessus pour l’ORF-M :
-

RT-PCR: 30 min à 42°C, 15 min à 55°C, 2 min à 94°C, puis l’ADNc obtenu est amplifié dans les conditions suivantes :
40 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 58°C pendant
30 sec puis une étape d’élongation à 68°C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d’élongation supplémentaire à chaque
cycle, puis une étape finale d’élongation à 68°C pendant 7 min.

-

PCR nichée : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min est suivie de 3 cycles comprenant : une étape
de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 60°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation
à 72°C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, puis une étape finale
d’élongation à 72°C pendant 7 min.

25

30

REGION
AMPLIFIEE ET
SEQUENCEE (ne
tient pas compte
des amorces)

[0212]
35

Les produits d’amplifications ont été séquencés à l’aide des amorces définies dans le Tableau III ci-après :
Tableau III : Amorces utilisées pour le séquençage de la région 5’ (ORF1a et ORF1b)
Noms

40

45

50

55

S/L3/+/4932
S/L4/+/6401
S/L4/+/6964
S/L4/-/6817
S/L5/-/7633
S/L5/-/8127
S/L5/-/8633
S/L5/+/7839
S/L5/+/8785
S/L5/+/8255
S/L6/-/9422
S/L6/-/9966
S/L6/-/10542
S/L6/+/10677
S/L6/+/10106
S/L6/+/9571
S/L7/-/11271
S/L7/-/11801

Séquences (SEQ ID NO : 76 à 139)
5’-CCACACACAGCTTGTGGATA-3’
5’-CCGAAGTTGTAGGCAATGTC-3’
5’-TTTGGTGCTCCTTCTTATTG-3’
5’-CCGGCATCCAAACATAATTT-3’
5’-TGGTCAGTAGGGTTGATTGG-3’
5’-CATCCTTTGTGTCAACATCG-3’
5’-GTCACGAGTGACACCATCCT-3’
5’-ATGCGACGAGTCTGCTTCTA-3’
5’-TTCATAGTGCCTGGCTTACC-3’
5’-ATCTTGGCGCATGTATTGAC-3’
5’-TGCATTAGCAGCAACAACAT-3’
5’-TCTGCAGAACAGCAGAAGTG-3’
5’-CCTGTGCAGTTTGTCTGTCA-3’
5’-CCTTGTGGCAATGAAGTACA-3’
5’-ATGTCATTTGCACAGCAGAA-3’
5’-CTTCAATGGTTTGCCATGTT-3’
5’-TGCGAGCTGTCATGAGAATA-3’
5’-AACCGAGAGCAGTACCACAG-3’

31

EP 1 694 829 B1
(suite)
Noms
5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

S/L7/-/12383
S/L7/+/12640
S/L7/+/12088
S/L7/+/11551
S/L8/-13160
S/L8/-/13704
S/L8/-14284
S/L8/+/14453
S/L8/+/13968
S/L8/+/13401
S/L9/-15098
S/L9/-15677
S/L9/-16247
S/L9/+16323
S/L9/+15858
S/L9/+15288
S/L10/-16914
S/L10/-17466
S/L10/-18022
S/L10/+18245
S/L10/+17663
S/L10/+17061
S/L11/-/18877
S/L11/-19396
S/L11 /-20002
S/L11 /+20245
S/L11/+/19611
S/L11/+/19021
SARS/L1/F3/+800
SARS/L1/F4/+1391
SARS/L1/F5/+1925
SARS/L1/R3/-1674
SARS/L1/R4/-1107
SARS/L1/R5/-520
SARS/L2/F3/+2664
SARS/L2/F4/+3232
SARS/L2/F5/+3746
SARS/L2/R3/-3579
SARS/L2/R4/-2991
SARS/L2/R5/-2529
SARS/L3/F3/+4708
SARS/L3/F4/+5305
SARS/L3/F5/+5822
SARS/L3/R3/-5610
SARS/L3/R4/-4988
SARS/L3/R5/-4437

Séquences (SEQ ID NO : 76 à 139)
5’-TTTGGCTGCTGTAGTCAATG-3’
5’-CTACGACAGATGTCCTGTGC-3’
5’-GAGCAGGCTGTAGCTAATGG-3’
5’-TTAGGCTATTGTTGCTGCTG-3’
5’-CAGACAACATGAAGCACCAC-3’
5’-CGCTGACGTGATATATGTGG-3’
5’-TGCACAATGAAGGATACACC-3’
5’-ACATAGCTCGCGTCTCAGTT-3’
5’-GGCATTGTAGGCGTACTGAC-3’
5’-GTTTGCGGTGTAAGTGCAG-3’
5’-TAGTGGCGGCTATTGACTTC-3’
5’-CTAAACCTTGAGCCGCATAG-3’
5’-CATGGTCATAGCAGCACTTG-3’
5’-CCAGGTTGTGATGTCACTGAT-3’
5’-CCTTACCCAGATCCATCAAG-3’
5’-CGCAAACATAACACTTGCTG-3’
5’-AGTGTTGGGTACAAGCCAGT-3’
5’-GTTCCAAGGAACATGTCTGG-3’
5’-AGGTGCCTGTGTAGGATGAA-3’
5’-GGGCTGTCATGCAACTAGAG-3’
5’-TCTTACACGCAATCCTGCTT-3’
5’-TACCCATCTGCTCGCATAGT-3’
5’-GCAAGCAGAATTAACCCTCA-3’
5’-AGCACCACCTAAATTGCATC-3’
5’-TGGTCCCTTTGAAGGTGTTA-3’
5’-TCGAACACATCGTTTATGGA-3’
5’-GAAGCACCTGTTTCCATCAT-3’
5’-ACGATGCTCAGCCATGTAGT-3’
5’-GAGGTGCAGTCACTCGCTAT-3’
5’-CAGAGATTGGACCTGAGCAT-3’
5’-CAGCAAACCACTCAATTCCT-3’
5’-AAATGATGGCAACCTCTTCA-3’
5’-CACGTGGTTGAATGACTTTG-3’
5’-ATTTCTGCAACCAGCTCAAC-3’
5’-CGCATTGTCTCCTGGTTTAC-3’
5’-GAGATTGAGCCAGAACCAGA-3’
5’-ATGAGCAGGTTGTCATGGAT-3’
5’-CTGCCTTAAGAAGCTGGATG-3’
5’-TTTCTTCACCAGCATCATCA-3’
5’-CACCGTTCTTGAGAACAACC-3’
5’-TCTTTGGCTGGCTCTTACAG-3’
5’-GCTGGTGATGCTGCTAACTT-3’
5’-CCATCAAGCCTGTGTCGTAT-3’
5’-CAGGTGGTGCAGACATCATA-3’
5’-AACATCAGCACCATCCAAGT-3’
5’-ATCGGACACCATAGTCAACG-3’

[0213] Les séquences des fragments L0 à L12 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le
n° 031589, correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO :41 à SEQ ID NO :54 dans la liste de séquences
jointe en annexe. Parmi ces séquences, seule celle correspondant aux fragments L5 comporte une différence nucléo-

32

EP 1 694 829 B1

5

tidique par rapport à la séquence correspondante de l’isolat AY278741-Urbani. Cette mutation t/c en position 7919
aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante, codée par l’ORF la: en
position 2552, une valine (codon gtt ; AY278741) est changée en alanine (codon gct) dans la souche de SARS-CoV
031589. En revanche, aucune mutation n’a été identifiée par rapport à la séquence correspondante de l’isolat
AY274119.3-Tor2. Les autres fragments ne présentent pas de différences par rapport aux séquences correspondantes
des isolats Tor2 et Urbani.
Exemple 2 : Production et purification de protéines N et S recombinantes de la souche de SARS-CoV issue du
prélèvement répertorié sous le numéro 031589

10

15

20

[0214] La protéine entière N et deux fragments polypeptidiques de la protéine S de la souche de SARS-CoV issue
du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 ont été produites chez E. coli, sous forme de protéines de fusion
comprenant une étiquette polyhistidine N-ou C-terminale. Dans les deux polypeptides S, les séquences hydrophobes
N et C-terminales de la protéine S (peptide signal : positions 1 à 13 et hélice transmembranaire : positions 1196 à 1218)
ont été délétées alors que l’hélice β (positions 565 à 687) et les deux motifs de type coiled-coils (positions 895 à 980 et
1155 à 1186) de la protéine S ont été préservés. Ces deux polypeptides sont constitués par : un fragment long (SL)
correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S et un fragment court (SC)
correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S. 1) Clonage des ADNc N,
SL et SC dans les vecteurs d’expression pIVEX2.3 et
pIVEX2.4

25

30

35

40

45

[0215] Les ADNc correspondant à la protéine N et aux fragments SL et SC ont été amplifiés par PCR dans des
conditions standard, à l’aide de l’ADN polymérase Platinium Pfx® (INVITROGEN). Les plasmides SRAS-N et SRAS-S
ont été utilisés comme matrice et les oligonucléotides suivants comme amorces :
5’-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3’ (N sens, SEQ ID NO :55)
5’-CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3’ (N antisens, SEQ ID NO :56)
5’-CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3’ (SC sens, SEQ ID NO :57)
5’-CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3’ (SL sens, SEQ ID NO :58)
5’-CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC-3’ (SC et SL antisens, SEQ ID NO :59).
[0216] Les amorces sens introduisent un site NdeI (souligné) alors que les amorces antisens introduisent un site XmaI
ou SmaI (souligné). Les 3 produits d’amplification on été purifiés sur colonne (kit QIAquick PCR Purification, QIAGEN)
et clonés dans un vecteur approprié. L’ADN plasmidique purifié des 3 constructions (kit QIAFilter Midi Plasmid, QIAGEN)
a été vérifié par séquençage et digéré par les enzymes NdeI et XmaI. Les 3 fragments correspondants aux ADNc N,
SL et SC ont été purifiés sur gel d’agarose puis insérés dans les plasmides pIVEX2.3MCS (étiquette polyhistidine Cterminale) et pIVEX2.4d (étiquette polyhistidine N-terminale) préalablement digérés par les mêmes enzymes. Après
vérification des constructions, les 6 vecteurs d’expressions ainsi obtenus (pIV2.3N, pIV2.3SC, pIV2.3SL, pIV2.4N,
pIV2.4SC également dénommé pIV2.4SI, pIV2.4SL) ont été ensuite utilisés, d’une part pour tester l’expression des
protéines in-vitro, et d’autre part pour transformer la souche bactérienne BL21(DE3)pDIA17 (NOVAGEN). Ces constructions codent pour des protéines dont la masse moléculaire attendue est la suivante : pIV2.3N (47174 Da), pIV2.3SC
(82897 Da), pIV2.3SL (132056 Da), pIV2.4N (48996 Da), pIV2.4SI (81076 Da) et pIV2.4SL(133877 Da). Des bactéries
transformées par pIV2.3N ont été déposées à la CNCM le 23 octobre 2003, sous le numéro I-3117, et des bactéries
transformées par pIV2.4SI ont été déposées à la CNCM le 23 octobre 2003, sous le numéro I-3118.
2) Analyse de l’expression des protéines recombinantes in-vitro et in vivo

50

55

[0217] L’expression de protéines recombinantes à partir des 6 vecteurs recombinants a été testée, dans un premier
temps, dans un système in-vitro (RTS100, Roche). Les protéines produites in vitro, après une incubation des vecteurs
recombinants pIVEX, 4h à 30°C, dans le système RTS100, ont été analysées par westem-blot à l’aide d’un anticorps
anti-(his)6 couplé à la péroxydase. Le résultat d’expression in-vitro (Figure 1) montre que seule la protéine N est exprimée
en quantités importantes, cela quelle que soit la position, N- ou C-terminale, de l’étiquette polyhistidine. Dans une
seconde étape, l’expression des protéines N et S a été testée in-vivo à 30°C dans du milieu LB, en présence ou en
l’absence d’inducteur (IPTG 1mM). La protéine N est très bien produite dans ce système bactérien (Figure 2) et se
retrouve principalement dans une fraction soluble après lyse des bactéries. En revanche, la version longue de S (SL)
est très peu produite et complètement insoluble (Figure 3). La version courte (SC) présente également une très faible
solubilité, mais un taux d’expression beaucoup plus élevé que celui de la version longue. Par ailleurs, la construction

33

EP 1 694 829 B1

5

SC fusionnée à une étiquette polyhistidine en position C-terminale présente une taille plus faible que celle attendue.
Une expérience d’immunodétection avec un anticorps anti-polyhistidine a montré que cette construction était incomplète.
En conclusion, les deux constructions, pIV2.3N et pIV2.4SI, exprimant respectivement la protéine N entière fusionnée
à l’étiquette polyhistidine en C-terminal et la protéine S courte fusionnée à l’étiquette polyhistidine en N-terminal, ont
été retenues pour produire les deux protéines en grande quantité afin de les purifier. Les plasmides pIV2.3N et pIV2.4SI
ont été déposés respectivement sous le n° I-3117 et I-3118 auprès de la CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS
15, le 23 octobre 2003.
3) Analyse de l’activité antigénique des protéines recombinantes

10

15

[0218] L’activité antigénique des protéines N, SL et SC a été testée par western-blot, à l’aide de deux échantillons de
sérum, provenant d’un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés 8 jours (M12) et 29 jours-(M13) après le début
des symptômes du SRAS. Le protocole expérimental est comme décrit à l’exemple 3. Les résultats illustrés par la figure
4 montrent (i) la séroconversion du patient, et (ii) que la protéine N possède une plus forte réactivité antigénique que la
protéine S courte.
4) Purification de la protéine N à partir de pIV2.3N

20

25

30

35

40

45

[0219] Plusieurs expériences de purification de la protéine N, produite à partir du vecteur pIV2.3N, ont été réalisées
selon le protocole suivant. Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées par le vecteur d’expression pIV2.3N, ont été
cultivées à 30°C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml d’ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand
la densité cellulaire, équivalente à A600 = 0,8, est atteinte (environ 3 heures). Après 2 heures de culture en présence
d’inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min à 5000 rpm), remises en suspension dans le
tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, NaCl 0,3 M, 20 mM imidazole, pH 8 contenant le mélange d’inhibiteurs de protéases
Complete®, Roche), et lysées par la presse de French (12000 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à
12000 rpm), le surnageant (50 ml) a été déposé à un débit de lml/min sur une colonne (15 ml) de chélation métallique
(Ni-NTA superflow, Qiagen), équilibrée par le tampon de lyse. Après lavage de la colonne par 200 ml de tampon de
lyse, la protéine N a été éluée par un gradient d’imidazole (20 →250 mM) en 10 volumes de colonne. Les fractions
contenant la protéine N ont été rassemblées et analysées par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions
dénaturantes puis coloration au bleu de Coomassie. Les résultats illustrés par la figure 5 montrent que le protocole
employé permet de purifier la protéine N avec une homogénéité très satisfaisante (95%) et un rendement moyen de 15
mg de protéine par litre de culture.
5) Purification de la protéine SC à partir de pIV2.4S C (pIV2.4SI)
[0220] Le protocole suivi pour purifier la protéine S courte est très différent de celui décrit ci-dessus car la protéine
est fortement agrégée dans le système bactérien (corps d’inclusion). Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées
par le vecteur d’expression pIV2.4SI ont été cultivées à 30°C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml
d’ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand la densité cellulaire, équivalente à A600 = 0,8, est atteinte (environ 3
heures). Après 2 heures de culture en présence d’inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min
à 5000 rpm), remises en suspension dans le tampon de lyse (0,1 M Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5), et lysées par la
presse de French (1200 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à 12000 rpm), le culot a été remis en
suspension dans 25 ml de tampon de lyse contenant 2% Triton X100 et 10 mM β-mercaptoéthanol, puis centrifugé
pendant 20 min à 12000 rpm. Le culot a été remis en suspension dans un tampon Tris-HCl 10 mM contenant 7 M urée,
et mis en agitation douce pendant 30 min à température ambiante. Ce dernier lavage des corps d’inclusion avec 7 M
urée est nécessaire pour éliminer la plupart des protéines membranaires d’E. coli qui co-sédimentent avec la protéine
SC agrégée. Après une dernière centrifugation pendant 20 min à 12000 rpm, le culot final est remis en suspension dans
le tampon Tris-HCl 10 mM. L’analyse électrophorétique de cette préparation (Figure 6) montre que la protéine S courte
peut être purifiée avec une homogénéité satisfaisante (environ 90%) à partir des corps d’inclusion (extrait insoluble).

50

Exemple 3 : Immunodominance de la protéine N

55

[0221] La réactivité des anticorps présents dans le sérum des patients atteints de pneumopathie atypique causée par
le coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV), vis-à-vis des différentes protéines de ce virus, a été analysée par westernblot dans les conditions décrites ci-après.

34

EP 1 694 829 B1
1) Matériel
a) lysat de cellules infectées par le SARS-CoV
5

[0222] Des cellules Vero E6 (2x106) ont été infectées par le SARS-CoV (isolat répertorié sous le numéro FFM/MA104)
à une multiplicité d’infection (M.O.I.) de 10-1 ou 10-2 puis incubées dans du milieu DMEM contenant 2% de SVF, à 35°C
dans une atmosphère contenant 5% de CO2. 48 heures plus tard, le tapis cellulaire a été lavé avec du PBS puis lysé
avec 500 Pl de tampon de dépôt préparé selon Laemmli et contenant du β-mercaptoéthanol. Les échantillons ont ensuite
été bouillis 10 minutes puis soniqués 3 fois 20 secondes.

10

b) anticorps
b1) sérum de patient atteint de pneumopathie atypique
15

20

[0223] Le sérum référencé au Centre National de Référence des virus influenzae (Région-Nord) sous le N° 20033168
est celui d’un patient français atteint d’une pneumopathie atypique causée par le SARS-CoV prélevé au jour 38 après
le début des symptômes ; le diagnostic d’infection par le SARS-CoV a été réalisé par RT-PCR nichée et PCR quantitative.
b2) sérums polyclonaux de lapin monospécifiques dirigés contre la protéine N ou la protéine S
[0224] Les sérums sont ceux produits à partir des protéines recombinantes N et SC (exemple 2), selon le protocole
d’immunisation décrit à l’exemple 4 ; il s’agit du sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) et du sérum du lapin P11135
(sérum anti-S).

25

30

35

40

45

50

55

2) Méthode
[0225] 20 Pl de lysat de cellules infectées par le SARS-CoV à des M.O.I. de 10-1 et 10-2 et, à titre de contrôle, 20 Pl
d’un lysat de cellules non infectées (mock) ont été séparés sur un gel SDS à 10% de polyacrylamide puis transférés
sur une membrane de nitrocellulose. Après blocage dans une solution de PBS/lait 5%/Tween 0,1% et lavage en PBS/
Tween 0,1%, cette membrane a été hybridée pendant une nuit à 4°C avec : (i) l’immun-sérum N° 20033168 dilué au
1/300, 1/1000 et 1/3000 dans le tampon PBS/BSA 1%/Tween 0,1%, (ii) le sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) dilué
au 1/50000 dans le même tampon et (iii) le sérum du lapin P11135 (sérum anti-S) dilué au 1/10000 dans le même
tampon. Après lavage en PBS/Tween, une hybridation secondaire a été réalisée à l’aide, soit d’anticorps polyclonaux
de mouton dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G humaines et couplés à la peroxidase
(NA933V, Amersham), soit d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés à l’aide du kit
ECL+ (Amersham) et de films d’autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham). Une échelle de masse moléculaire (kDa)
est portée sur la figure.
3) Résultats
[0226] La figure 7 montre que trois polypeptides de masse moléculaire apparente 35, 55 et 200 kDa sont détectés
spécifiquement dans les extraits de cellules infectées par le SARS-CoV.
[0227] Afin d’identifier ces polypeptides, deux autres immunoempreintes (figure 8) ont été réalisées sur les mêmes
échantillons et dans les mêmes conditions avec des anticorps polyclonaux de lapins spécifique de la nucléoprotéine N
(lapin P13097, figure 8A) et de la protéine de spicule S (lapin P11135, figure 8B) Cette expérience montre que le
polypeptide de 200 kDa correspond à la glycoprotéine de spicule S du SARS-CoV, que le polypeptide de 55 kDa
correspond à la nucléoprotéine N tandis que le polypeptide de 35 kDa représente vraisemblablement une forme tronquée
ou dégradée de la N.
[0228] Les données présentées dans la figure 7 montrent donc que le sérum 20033168 réagit fortement avec la N et
beaucoup plus faiblement avec la S du SARS-CoV, puisque les polypeptides de 35 et 55 kDa sont révélés sous la forme
de bandes intenses pour des dilutions de 1/300, 1/1000 et 1/3000 de l’immunsérum alors que le polypeptide de 200
kDa n’est que faiblement révélé pour une dilution de 1/300. On peut noter également qu’aucun autre polypeptide du
SARS-CoV n’est détecté pour des dilutions supérieures au 1/300 du sérum 20033168.
[0229] Cette expérience indique que la réponse en anticorps spécifique de la N du SARS-CoV domine les réponses
en anticorps spécifiques des autres polypeptides du SARS-CoV et en particulier la réponse en anticorps dirigée contre
la glycoprotéine S. Elle indique une immunodominance de la nucléoprotéine N lors des infections humaines par le SARSCoV.

35

EP 1 694 829 B1
Exemple 4 : Réparation d’anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines N et S du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV)
1) Matériel et méthode
5

10

15

20

25

[0230] Trois lapins (P13097, P13081, P13031) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant purifié correspondant à l’intégralité de la nucléoprotéine (N), préparé selon le protocole décrit à l’exemple 2. Après une première injection
de 0,35 mg par lapin de protéine émulsionnée en adjuvant complet de Freund (voie intradermique), les animaux ont
reçus 3 injections de rappel à 3 puis 4 semaines d’intervalle, de 0,35 mg de protéine recombinante émulsionnée en
adjuvant incomplet de Freund.
[0231] Trois lapins (P11135, P13042, P14001) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant correspondant au
fragment court de la protéine S (SC), produit comme décrit à l’exemple 2. Comme ce polypeptide est retrouvé principalement sous la forme de corps d’inclusion dans le cytoplasme bactérien, les animaux ont reçus 4 injections intra-dermiques
à 3-4 semaines d’intervalle d’une préparation de corps d’inclusion correspondant à 0,5 mg de protéine recombinante
émulsionnée en adjuvant incomplet de Freund. Les 3 premières injections ont été réalisées avec une préparation de
corps d’inclusion préparés selon le protocole décrit à l’exemple 2, tandis que la quatrième injection a été réalisée avec
une préparation de corps d’inclusion qui ont été préparés selon le protocole décrit à l’exemple 2 puis purifiés sur gradient
de saccharose et lavés en 2 % Triton X100.
[0232] Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la première immunisation et un immunsérum (I.S.) 5 semaines après la quatrième immunisation.
[0233] Dans un premier temps, la réactivité des sérums a été analysée par test ELISA vis à vis de préparations de
protéines recombinantes semblables à celles utilisées pour les immunisations ; les tests ELISA ont été réalisés selon
le protocole et avec les réactifs tels que décrits à l’exemple 6.
[0234] Dans un deuxième temps, la réactivité des sérums a été analysée en réalisant une immunoempreinte (western
blot) d’un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV, en suivant le protocole tel que décrit à l’exemple 3.
2) Résultats

30

35

40

45

[0235] Les tests ELISA (figure 9) démontrent que les préparations de protéine N recombinante et de corps d’inclusion
du fragment court de la protéine S (SC) sont immunogènes chez l’animal et que le titre des sérums immuns est élevé
(plus de 1/25000).
[0236] L’immunoempreinte (figure 8) montre que le sérum immun du lapin P13097 reconnaît deux polypeptides présents dans les lysats de cellules infectées par le SARS-CoV : un polypeptide dont la masse moléculaire apparente
(50-55 kDa selon les expériences) est compatible avec celle de la nucléoprotéine N (422 résidus, masse moléculaire
prédite de 46 kDa) et un polypeptide de 35 kDa, qui représente vraisemblablement une forme tronquée ou dégradée
de la N.
[0237] Cette expérience montre également que le sérum du lapin P11135 reconnaît principalement un polypeptide
dont la masse moléculaire apparente (180-220 kDa selon les expériences) est compatible avec une forme glycosylée
de la S (1255 résidus, chaîne polypeptidique non glycosylée de 139 kDa), ainsi que des polypeptides plus légers, qui
représentent vraisemblablement des formes tronquées et/ou non glycosylées de la S.
[0238] En conclusion, l’ensemble de ces expériences démontrent que des polypeptides recombinants exprimés chez
E. coli et correspondant aux protéines N et S du SARS-CoV permettent d’induire chez l’animal des anticorps polyclonaux
capables de reconnaître les formes natives de ces protéines.
Exemple 5 : Préparation d’anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines M et E du
coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV)
1) Analyse de la structure des protéines M et E

50

a) Protéine E

55

[0239] La structure de la protéine E du SARS-CoV (76 acides aminés) a été analysée in silico , à l’aide de différents
logiciels comme signalP v1.1, NetNGlyc 1.0, THMM 1.0 et 2.0 (Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol., 305(3):567-580) ou
encore TOPPRED (von Heijne, 1992, J. Mol. Biol. 225, 487-494). L’analyse montre que ce polypeptide non glycosylé
est une protéine membranaire de type 1, contenant une seule hélice transmembranaire (aa 12-34 d’après THMM), et
dont la plus grande partie du domaine hydrophile (42 résidus) est localisée à l’extrémité C-terminale et vraisemblablement
à l’intérieur de la particule virale (endodomaine). On peut noter une inversion dans la topologie prédite par les versions
1.0 (N-ter est externe) et 2.0 (N-ter est interne) du logiciel THMM, mais que d’autres algorithmes, notamment TOPPRED

36

EP 1 694 829 B1
et THUMBUP (Zhou et Zhou, 2003, Protein Science 12 :1547-1555) confirment une localisation externe de l’extrémité
N-terminale de E.
b) Protéine M
5

10

[0240] Une analyse similaire réalisée sur la protéine M du SARS-CoV (221 acides aminés) montre que ce polypeptide
ne possède pas de peptide signal (d’après le logiciel signalP v1.1) mais trois domaines transmembranaires (résidus
15-37, 50-72, 77-99 d’après THMM2.0) et un grand domaine hydrophile (aa 100-221) localisé à l’intérieur de la particule
virale (endodomaine). Elle est vraisemblablement glycosylée sur l’asparagine en position 4 (d’après NetNGlyc 1.0).
[0241] Ainsi, en accord avec les données expérimentales connues pour les autres coronavirus, il est remarquable
que les deux protéines M et E présentent des endodomaines correspondant à la majeure partie des polypeptides et des
ectodomaines de très petite taille.
-

15

-

l’ectodomaine de E correspond vraisemblablement aux résidus 1 à 11 ou 1 à 12 de la protéine : MYSFVSEETGT
(L), SEQ ID NO : 70. En effet, la probabilité associée à la localisation transmembranaire du résidu 12 est intermédiaire
(0,56 d’après THMM 2.0).
l’ectodomaine de M correspond vraisemblablement aux résidus 2 à 14 de la protéine : ADNGTITVEELKQ, SEQ ID
NO : 69. En effet, la méthionine N-terminale de M est très probablement clivée du polypeptide mature car le résidu
en position 2 est une Alanine (Varshavsky, 1996, 93:12142-12149).

20

25

[0242] Par ailleurs, l’analyse de l’hydrophobicité (Kyte & Doolittle, Hopp & Woods) de la protéine E met en évidence
que l’extrémité C-terminale de l’endodomaine de E est hydrophile et donc vraisemblablement exposée à la surface de
ce domaine. Ainsi, un peptide synthétique correspondant à cette extrémité est un bon candidat immunogène pour induire
chez l’animal des anticorps dirigés contre l’endodomaine de E. En conséquence, un peptide correspondant aux 24
résidus C-terminaux de E a été synthétisé.
2) Préparation d’anticorps dirigés contre l’ectodomaine des protéines M et E et l’endodomaine de la protéine E

30

35

40

45

50

55

[0243] Les peptides M2-14 (ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO : 69), E1-12 (MYSFVSEETGTL, SEQ ID NO: 70) et
E53-76 (KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV, SEQ ID NO : 71) ont été synthétisés par Neosystem. Ils ont été couplés
à la KLH (Keyhole Limpet Heinocyanin) à l’aide du MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) via une
cystéine ajoutée au cours de la synthèse soit en N-terminal du peptide (cas de E53-76) soit en C-terminal (cas de M2-14
et E1-12).
[0244] Deux lapins ont été immunisés avec chacun des conjugués, en suivant le protocole d’immunisation suivant :
après une première injection de 0,5 mg de peptide couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant complet de Freund (voie
intradermique), les animaux reçoivent 2 à 4 injections de rappel à 3 ou 4 semaines d’intervalle de 0,25 mg de peptide
couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant incomplet de Freund.
[0245] Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la première immunisation et un immunsérum (I.S.) est préparé 3 à 5 semaines après les injections de rappel.
[0246] La réactivité des sérums a été analysée par western blot à l’aide d’extraits de cellules infectées par le SRASCoV (figure 43B) ou à l’aide d’extraits de cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine exprimant la protéine
E (VV-TG-E, figure 43A) ou M (VV-TN-M, figure 43C) de l’isolat 031589 du SRAS-CoV.
[0247] Les immunsérums des lapins 22234 et 22240, immunisés par le conjugué KLH-E53-76, reconnaissent un
polypeptide d’environ 9 à 10kD, qui est présent dans les extraits de cellules infectées par le SRAS-CoV mais absent
dans les extraits de cellules non infectées (figure 43B). La masse apparente de ce polypeptide est compatible avec la
masse prédite de la protéine E, qui est de 8,4 kD. De façon similaire, l’immunsérum du lapin 20047, immunisé par le
conjugué KLH-E1-12, reconnaît un polypeptide présent dans les extraits de cellules infectées par le virus VV-TG-E,
dont la masse molaire apparente est compatible avec celle de la protéine E (figure 43A).
[0248] L’immunsérum des lapin 20013 et 20080, immunisés par le conjugué KLH-M2-14, reconnaît un polypeptide
présent dans les extraits de cellules infectées par le virus VV-TN-M (figure 43C), dont la masse molaire apparente (18
kD environ) est compatible avec celle de la glycoprotéine M, qui est de 25,1 kD et présente un point isoélectrique élevé
(9.1 pour le polypeptide nu).
[0249] Ces résultats démontrent que les peptides El-12 et E53-76 d’une part et le peptide M2-14 d’autre part permettent
d’induire chez l’animal des anticorps polyclonaux capables de reconnaître les formes natives des protéines E et M
respectivement du SRAS-CoV.

37

EP 1 694 829 B1
Exemple 6 : Analyse de la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante, vis-à-vis de sérums de patients
atteints de SRAS
1) Matériel
5

[0250] L’antigène utilisé pour préparer les phases solides est la nucléoprotéine N recombinante purifiée préparée
selon le protocole décrit à l’exemple 2.
[0251] Les sérums à tester (Tableau IV) ont été choisis sur la base des résultats d’analyse de leur réactivité par
immunofluorescence (titre IF-SRAS), vis-à-vis de cellules infectées par le SARS-CoV.
10

Tableau IV: Sérums testés en ELISA

15

20

Référence

N° sérum

Type de sérum

Date du Sérum***

Titre IF-SRAS

3050

A

Témoin

na*

nt**

3048

B

Témoin

na

nt

033168

D

Patient 1- SRAS

27/04/03 (J38)

320

033397

E

Patient-1 SRAS

11/05/03 (J52)

320

032632

F

Patient-2 SRAS

21/03103 (J17)

2500

032791

G

Patient-3 SRAS

04/04/03 (J3)

<40

033258

H

Patient-3 SRAS

28/04/03 (J27)

160

*na : non-applicable. ** nt : non-testé. *** les dates indiquées correspondent au nombre
de jours après le début des symptômes de SRAS.

25

2) Méthode
30

35

40

45

[0252] La protéine N (100 Pl) diluée à différentes concentrations dans du tampon carbonate 0,1 M, pH 9,6 (1, 2 ou 4
Pg/ml) est distribuée dans les puits de plaques ELISA, puis les plaques sont incubées une nuit à température du
laboratoire. Les plaques sont lavées avec du tampon PBS-Tween, saturées avec du tampon PBS-lait écrémé-saccharose
(5 %). Les sérums à tester (100 Pl) préalablement dilués (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 et 1/3200) sont
ajoutés, puis les plaques sont incubées 1 h à 37° C. Après 3 lavages, le conjugué anti-IgG humaines marqué à la
peroxydase (référence 209-035-098, JACKSON) dilué au 1/18000 est ajouté puis les plaques sont incubées 1h à 37
°C. Après 4 lavages, le chromogène (TMB) et le substrat (H202) sont ajoutés et les plaques sont incubées 30min à
température ambiante, à l’abri de la lumière. La réaction est ensuite arrêtée puis l’absorbance à 450 nm est mesurée
à l’aide d’un lecteur automatique.
3) Résultats
[0253] Les tests ELISA (figure 10) démontrent que la préparation de protéine N recombinante est reconnue spécifiquement par les anticorps de sérums de patients atteints de SRAS prélevés en phase tardive de l’infection (≥ 17 jours
après le début des symptômes) alors qu’elle n’est pas reconnue de façon significative par les anticorps d’un sérum de
patient prélevé en phase précoce de l’infection (3 jours après le début des symptômes) ni par des sérums témoins de
sujets non atteints de SRAS.
Exemple 7 : Tests ELISA élaborés pour une détection très spécifique et sensible d’une infection par le coronavirus associé au SRAS, à partir de sérums de patients

50

1) Test ELISA IgG indirect
a Réactifs

55

Préparation des plaques
[0254] Les plaques sont sensibilisées par une solution de protéine N à 2Pg/mL dans un tampon PBS 10mM pH 7,2,
rouge de phénol à 0,25mL /L. 100 PL de solution sont déposés dans les puits et laissés incubés à température ambiante

38

EP 1 694 829 B1
pendant une nuit. La saturation se fait par un prélavage en tampon PBS 10mM / tween 0,1%, suivi d’un lavage avec
une solution de saturation PBS, 25% lait /saccharose.

Diluant serums
5

[0255]

Tampon TRIS 0,48g/L, PBS 10mM, EDTA 3,7g/L,lait 15% v/v , pH 6,7

Diluant conjugué
10

[0256]

Tampon citrate (15g/L), tween 0,5% , sérum bovin 25%, NaCl 12%, lait écrémé 6% v/v PH 6,5

Conjugué
[0257]

Conjugué anti-IgG humaines 50X, commercialisés par Bio-Rad : kit Platelia H. pylori ref 72778

15

Autres solutions :
[0258] Solution de lavage R2, Solutions de révélation au TMB R8 diluant, R9 chromogène, R10 solution d’arrêt :
réactifs commercialisés commercialisées par Bio-Rad (ex : kit Platelia pylori, ref 72778)
20

b) Mode opératoire
[0259]
25

30

35

40

Diluer les serums au 1/200 dans le diluant échantillons
Distribuer 100PL/puits
Incubation 1h à 37°C
3 lavages en solution de LAVAGE R2 10x préalablement diluée 10 fois en eau déminéralisée (i.e., solution de lavage
1X)
Distribuer 100PL de conjugué (conjugué 50x à diluer extemporanément dans le diluant conjugué fourni)
Incubation 1h à 37°C
4 lavages en solution de lavage 1X
distribuer 200PL/puits de solution de révélation (à diluer extemporanément ex: mL de R9 dans 10mL de R8)
Incubation 30 min à température ambiante à l’obscurité
arrêter la réaction avec 100PL/puits de R10
LECTURE à 450/620nm
[0260] Les résultats peuvent être interprétés en prenant un sérum SEUIL donnant une réponse au delà de laquelle
les serums testés seront considérés comme positifs. Ce sérum est choisi et dilué de façon à donner un signal significativement supérieur au bruit de fond.
2) Test ELISA DOUBLE EPITOPE
a Réactifs

45

Préparation des plaques

50

[0261] Les plaques sont sensibilisées par une solution de protéine N à 1Pg/mL dans un tampon PBS 10mM pH 7,2,
rouge de phénol à 0,25mL /L. 100 PL de solution sont déposés dans les puits et laissés incubés à température ambiante
pendant une nuit. La saturation se fait par un prélavage en tampon PBS 10mM / O,1% tween suivi d’un lavage avec
une solution de saturation PBS 10mM, lait 25% (V/V)

Diluant serums et conjugué
55

[0262]

Tampon TRIS saline 50mMpH8, lait 2%

39

EP 1 694 829 B1
Conjugué

5

[0263] Il s’agit de la protéine N recombinante purifiée, couplée à la peroxidase selon le protocole de Nakane (Nalcane
P.K. and Kawaoi A; (1974) : Peroxydase-labeled antibody, a new method of conjugation. The Journal of Histochemistry
and Cytochemistry Vol22, N)23, pp 1084-1091.), dans des ratios molaires respectifs 1/2. Ce conjugué ProtN POD est
utilisé à une concentration de 2Pg/mL dans du diluant serum/conjugué.

Autres solutions :
10

[0264] Solution de lavage R2, Solutions de révélation au TMB R8, diluant, R9 chromogène, R10 solution d’arrêt :
réactifs commercialisées par Bio-Rad (ex kit platelia pylori ref 72778).
b) Mode opératoire

15

1ere étape en plaque de "prédilution"
[0265]

20

■ Diluer chaque sérum au 1/5 dans la plaque de prédilution (48 PL de diluant +12 PL de sérum).
■ Après avoir dilués l’ensemble des serums, distribuer 60PL de conjugué
■ Le cas échéant, le mélange sérum + conjugué est laissé à incuber.

2eme étape en plaque de "réaction"
25

30

[0266]
■ Transférer 100PLde mélange/puits dans la plaque de réaction
■ Incubation 1h 37°C
■ 5 lavages en solution de LAVAGE R2 10x préalablement diluée 10 fois en eau déminéralisée (--> solution de
lavage 1x)
■ distribuer 200PL/puits de solution de révélation (à diluer extemporanément ex:l mL de R9 dans 10mL de R8)
■ incubation 30min à température ambiante à l’abri de la lumière
■ arrêter la réaction avec 100PL/puits de R10
■ LECTURE à 450/620nm

35

[0267] De même que pour le test ELISA indirect, les résultats peuvent être interprétés en utilisant un serum "valeur
seuil". Tout serum ayant une réponse supérieure au sérum valeur seuil sera considéré comme positif.
2) Résultats
40

45

50

55

[0268] Les sérums de patients classés comme cas probables de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam ou en
relation avec l’hôpital français de Hanoi (JYK) ont été analysés en utilisant le test IgG-N indirect et le test N double épitope.
[0269] Les résultats du test IgG-N indirect (figures 14 et 15) et N double épitope (figures 16 et 17) montrent une
excellente corrélation entre eux ainsi qu’avec un test ELISA indirect comparant la réactivité des sérums vis-à-vis d’un
lysat de cellules VeroE6 non infectées ou infectées par le SRAS-CoV (ELISA-lysat SRAS-CoV ; voir le Tableau V ciaprès). Tous les sérums prélevés 12 jours ou plus après le début des symptômes ont été trouvés positifs, y compris
chez des patients pour lesquels l’infection par le virus du SRAS-CoV n’avait pas pu être documentée par analyse de
prélèvements respiratoires par RT-PCR, vraisemblablement en raison d’un prélèvement trop tardif au cours de l’infection
(≥ J12). Dans le cas du patient TTH pour lequel un prélèvement nasal réalisé à J7 a été trouvé négatif par RT-PCR, la
qualité du prélèvement pourrait être en cause.
[0270] Certains sérums ont été trouvés négatifs alors que la présence de SRAS-CoV a été détectée par RT-PCR. Il
s’agit dans tous les cas de sérums précoces prélevés moins de 10 jours après le début des symptômes (ex : sérum #
032637). Dans le cas d’un patient PTTH (sérum # 032673), seule une suspicion de SRAS était évoquée au moment où
les prélèvements ont été réalisés.
[0271] En conclusion, les tests sérologiques IgG-N indirect et N-double épitope permettent de documenter l’infection
par le SRAS-CoV chez tous les patients pour des sérums prélevés 12 jours ou plus après l’infection.

40

EP 1 694 829 B1
Tableau V : Résultats des tests ELISA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Num Pvt

Patient

Jour

PCR-SARS (1)

ELISA lysat
SRAS-CoV (2)

IgG-N (2ème série)

2Xepitope (2ème
série)

033168

JYK

38

POS

+++

>5000

NT

033597

JYK

74

POS

NT

≈ 5000

NT

032552

VTT

8

NEG-J3&J8&J12

NEG

<200

<5

032544

CTP

16

NEG J16&J20

++

>5000

>>20

032546

CJF

15

NEG J15&J19

++

>5000

>>20

032548

PTL

17

NEG J17&J21

++

>5000

>>20

032550

NTH

17

NEG-J17&J21

++

>5000

>>20

032553

VTT

8

NEG-J3&J8&J12

NEG

<200

<5

032554

NTBV

4

POS

NEG

<200

<5

032555

NTBV

4

POS

NEG

<200

032564

NTP

15

POS

++

>5000

>>20

032629

NVH

4

POS

NEG

<200

<5

032631

BTTX

9

POS

NEG

<200

<5

032635

NHH

4

POS

NEG

<200

<5

032637

NHB

10

POS

NEG

<200

<5

032642

BTTX

9

POS

NEG

<200

<5

032643

LTDH

1

POS

NEG

<200

<5

032644

NTBV

4

POS

NEG

<200

<5

032646

TTH

12

NEG J7&J12&J16

++

>5000

>>20

032647

DTH

17

NEG J17&J21

++

>5000

>>20

032648

NNT

15

NEG J15&J19

++

>5000

>>20

032649

PTH

17

NEG J17&J21

++

>5000

>>20

032672

LVV

16

NEG J16&J20

+

>5000

>>20

032673

PTTH

NA

NEG

<200

<5

032674

PNB

17

NEG J17&J21

++

>5000

>>20

032682

VTH

12

NEG J12&J16

++

>5000

>>20

032683

DTV

17

NEG J17&J21

+

>1000

>>20

NEG

Notes:
(1) : Les analyses par RT-PCR ont été réalisées par RT-PCR nichée BNI, LC Artus et LC-N sur des écouvillonnages
nasaux ou pharyngés; POS signifie qu’au moins un prélèvement a été trouvé positif chez ce patient.
(2) : La réactivité des sérums dans le test ELISA utilisant un lysat de cellules infectées par le SRAS-CoV a été classée
en très fortement réactif (+++), fortement réactif (++), réactif (+) et négatif en fonction de la valeur DO obtenue aux
dilutions testées

55

41

EP 1 694 829 B1
Exemple 8 : Détection du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) par RT-PCR
1) Mise au point de conditions de RT-PCR en temps réel à l’aide d’amorces spécifiques du gène de la protéine
de nucléocapside - test "Light Cycler N"
5

a) conception des amorces et des sondes

10

[0272] La conception des amorces et sondes a été réalisée à partir de la séquence du génome de la souche de SARSCoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589, à l’aide du programme "Light Cycler Probe Design (Roche)".
Ainsi les deux séries d’amorces et de sondes suivantes ont été sélectionnées :
- série 1 (SEQ ID NO : 60, 61, 64, 65):
[0273]

15

-

amorce sens : N/+/28507 : 5’-GGC ATC GTA TGG GTT G-3’ [28507-28522]
amorce antisens : N/-/28774 : 5’-CAG TTT CAC CAC CTC C-3’ [28774-28759]
sonde 1 : 5’-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-fluorescéine 3’ [28561-28586]
sonde 2 : 5’ Red705 -GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-phosphate [28588-28608]

20

- série 2 (SEQ ID NO : 62, 63, 66, 67)
[0274]
25

-

30

b) analyse de l’efficacité des deux couples amorces

35

[0275] Afin de tester l’efficacité respective des deux couples d’amorces, une amplification par RT-PCR a été réalisée
sur un ARN synthétique correspondant aux nucléotides 28054-29430 du génome de la souche de SARS-CoV issue du
prélèvement répertorié sous le numéro 031589et contenant la séquence du gène N.
[0276] De manière plus précise :

40

45

50

55

amorce sens : N/+/28375 : 5’-GGC TAC TAC CGA AGA G-3’ [28375-28390]
amorce antisens : N/-/28702 : 5’-AAT TAC CGC GAC TAC G-3’ [28702-28687]
sonde 1 : SRAS/N/FL : 5’-ATA CAC CCA AAG ACC ACA TTG GC - fluorescéine 3’ [28541-28563]
sonde 2 : SRAS/N/LC705 : 5’ Red705 -CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C-phosphate 3’ [28565-28589]

Cet ARN synthétique a été préparé par transcription in vitro à l’aide de l’ARN polymérase du phage T7, d’une matrice
d’ADN obtenu par linéarisation du plasmide SRAS-N avec l’enzyme Bam H1. Après élimination de la matrice d’ADN
par digestion à l’aide de DNAse 1, les ARN synthétiques sont purifiés par une extraction au phénol-chloroforme
suivie de deux précipitations successives en acétate d’ammonium et isopropanol. Ils sont alors quantifiés par mesure
de l’absorbance à 260 nm et leur qualité est contrôlée par le rapport des absorbances à 260 et 280 nm ainsi que
par une électrophorèse en gel d’agarose. Ainsi, la concentration de la préparation d’ARN synthétique utilisée pour
ces études est de 1,6 mg/ml, ce qui correspond à 2,1.1015 copies/ml d’ARN.
[0277] Des quantités décroissantes d’ARN synthétique ont été amplifiés par RT-PCR à l’aide du kit "Superscript™
One-Step RT-PCR with Platinum® Taq" et les couples d’amorces n° 1 (N/+/28507, N/-/28774) (figure 1A) et n° 2 (N/+/
28375, N//28702) (figure 1B), en suivant les indications du fournisseur. Les conditions d’amplification utilisées sont les
suivantes : l’ADNc a été synthétisé par incubation 30 min à 45 °C, 15 min à 55°C puis 2 min à 94 °C puis il a été amplifié
par 5 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 45°C pendant
30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 30 sec, suivis de 35 cycles comprenant : une étape de dénaturation
à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 55°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 30
sec, avec 2 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, et d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min.
Les produits d’amplification obtenus ont ensuite été maintenus à 10°C.
[0278] Les résultats présentés à la figure 11 montrent que le couple d’amorces n° 2 (N/+/28375, N/-/28702) permet
de détecter jusqu’à 10 copies d’ARN (bande de faible intensité) ou 102 copies (bande de bonne intensité) contre 104
copies pour le couple d’amorces n° 1 (N/+/28507, N/-/28774). Les amplicons sont respectivement de 268 pb (couple 1)
et de 328 pb (couple 2).

42

EP 1 694 829 B1
c) mise au point de la RT-PCR en temps réel

5

10

[0279] Une RT-PCR en temps réel a été mise au point à l’aide du couple d’amorces n°2 et du couple de sonde constitué
par SRAS/N/FL et SRAS/N/LC705 (figure 2).
[0280] L’amplification a été réalisée sur un LightCycler™ (Roche) à l’aide du kit "Light Cycler RNA Amplification Kit
Hybridization Probes " (référence 2 015 145, Roche) dans les conditions optimisées suivantes. Un Mélange réactionnel
contenant : H2O (6,8 Pl), MgCl2 25 mM (0,8 Pl, 4 PM final de Mg2+), mélange réactionnel 5X (4 Pl), sonde SRAS/N/FL
3 PM (0,5 Pl, 0,075 PM final), sonde SRAS/N/LC705 3 PM (0,5 Pl, 0,075 PM final), amorce N/+/28375 10 PM (1 Pl, 0,5
PM final), amorce N/-/28702 10 PM (1 Pl, 0,5 PM final), mélange d’enzyme (0,4 Pl) et échantillon (ARN viral, 5 Pl) a été
amplifié en suivant le programme suivant :
-

15

-

20

25

30

Transcription inverse : 50°C 10:00min analysis mode: none
Dénaturation : 95°C 30sec x1 analysis mode: none
Amplification : 95°C 2sec }
50°C . 15sec analysis mode: quantification*} x45
72°C 13sec rampe thermique 2,0°C/sec }
refroidissement : 40°C 30sec x1 analysis mode: none

*La mesure de fluorescence se fait à la fin de l’hybridation et à chaque cycle (en mode SINGLE).
[0281] Les résultats présentés à la figure 12 montrent que cette RT-PCR en temps réel est très sensible puisqu’elle
permet de détecter 102 copies d’ARN synthétique dans 100% des 5 échantillons analysés (29/29 échantillons dans 8
expériences) et jusqu’à 10 copies d’ARN dans 100% des 5 échantillons analysés (40/45 échantillons dans 8 expériences).
Elle montre également que cette RT-PCR permet de détecter la présence du génome du SARS-CoV dans un échantillon
et de quantifier le nombre de génomes présents. A titre d’exemple, l’ARN viral d’un stock de SARS-CoV cultivé sur
cellules Vero E6 a été extrait à l’aide du kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen), dilué à 0,05.10-4 et analysé par RTPCR en temps réel selon le protocole décrit ci-dessus; l’analyse présentée à la figure 12 montre que ce stock de virus
contient 6,5.109 génomes -équivalents/ml (geq/ml), ce qui est tout à fait similaire à la valeur de 1,0.1010 geq/ml mesurée
à l’aide du kit "RealArt™ HPA-Coronavirus LC RT PCR Reagents" commercialisé par Artus.
2) Mise au point de conditions de RT-PCR nichée ciblant le gène de l’ARN polymérase - test "RT-PCR nichée
CDC (Centers for Disease Control and Prevention) /IP"
a) Extraction de l’ARN viral

35

[0282] Echantillon clinique : QIAamp viral RNA Mini Kit (QIAGEN) selon les indications du fabricant, ou une technique
équivalente. L’ARN est élué dans un volume de 60 Pl.
b) RT-PCR nichée "SNE/SAR"

40

Première étape : RT-PCR couplée « SNE »
[0283] Le kit Invitrogen "Superscript™ One-Step RT-PCR with Platinum® Taq"a été utilisé, mais le kit "Titan" de
Roche Boehringer peut lui être substitué avec des résultats similaires.

45

Oligonucléotides :
[0284]

50

-

SNE-S1 5’ GGT TGG GAT TAT CCA AAA TGT GA 3’
SNE-AS1 5’GCA TCA TCA GAA AGA ATC ATC ATG 3’

-> Taille attendue :440 pb
1. Préparer un mix :
55

H2O
Reaction mix 2X
Oligo SNE-S1 50 PM

43

6,5 Pl
12,5 Pl
0,2 Pl

EP 1 694 829 B1
(suite)
Oligo SNE-AS1 50 PM
RNAsin 40 U/Pl
RT/Platinum Taq mix

5

0,2 Pl
0,12 Pl
0, 5 Pl

2. A 20 Pl du mix, ajouter 5 Pl d’ARN et procéder à l’amplification sur thermocycleur (conditions ABI 9600) :
2.1
10

2.2.
15

2.3.

2.4.
2.5

20

25

45°C
55°C
94°C
94°C
45°C
72°C
94°C
55°C
72°C
72°C
10°C

30 min.
15 min.
2 min.
15 sec.
30 sec.
30 sec.
15 sec.
30 sec.
30 sec. + 2sec./cycle
5 min.


}
} x 5 cycles
}
}
} x 35 cycles
}

Conservation à +4°C.
[0285] La RNAsin (N2511/N2515) de Promega a été utilisée comme inhibiteurs de RNase.
[0286] Des ARN synthétiques ont servi de témoin positif. A titre de contrôle, 103, 102 et 10 copies d’ARN synthétique
RSNE ont été amplifiées dans chaque expérience.

Seconde étape : PCR nichée "SAR"
30

Oligonucléotides :
[0287]

35

-

SAR1-S 5’ CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA 3’
SAR1-AS 5’ TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG 3’

-> Taille attendue : 121 pb
1. Préparer un mix :
H2O
Tampon Taq 10X
MgCl2 25 mM
Mix dNTPs 5 mM
Oligo SAR1-S 50 PM
Oligo SAR1-AS 50 PM
Taq ADN pol 5 U/Pl

40

45

50

35,8 Pl
5 Pl
4 Pl
2 Pl
0,5 Pl
0,5 Pl
0,25 Pl

L’AmpliTaq DNA Pol d’Applied Biosystems a été utilisée (tampon 10X sans MgCl2, réf 27216601).
2. A 48 Pl du mix, ajouter 2 Pl du produit de la première PCR et procéder à l’amplification (conditions ABI 9600) :
2.1.
2.2.

55

2.3.

94°C
94°C
45°C
72°C
94°C
55°C

2 min.
30 sec.
45 sec.
30 sec.
30 sec.
30 sec.

}
} x 5 cycles
}
}
} x 35 cycles

44

EP 1 694 829 B1
(suite)
2.4.
2.5

5

10

72°C
72°C
10°C

30 sec. + 1sec./cycle
5 min.


}

3. Analyser 10 Pl du produit réactionnel sur gel "low-melting" (type Seakem GTG) à 3% d’agarose.
La sensibilité du test niché est en routine, dans les conditions décrites, de 10 copies d’ARN.
4. Les fragments peuvent ensuite être purifiés sur QIAquick PCR kilt (QIAGEN) et séquencés avec les oligos SAR1-S
et SAR1-AS.
3) Détection de l’ARN du SARS-CoV par PCR à partir de prélèvements respiratoires
a) Première étude comparative

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0288] Une étude comparative a été réalisée sur une série de prélèvements respiratoires reçus par le Centre National
de Référence du Virus Influenzae (région nord) et susceptibles de contenir du SARS-CoV. Pour ce faire, l’ARN a été
extrait des prélèvements à l’aide du kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen) et analysé par RT-PCR en temps réel,
d’une part à l’aide des couples d’amorces et de sondes de la série n° 2 dans les conditions décrites ci-dessus d’une
part, et d’autre part à l’aide du kit "LightCycler SARS-CoV quantification kit" commercialisé par Roche (référence 03 604
438). Les résultats sont résumés dans le Tableau VI ci-dessous. Ils montrent que 18 des 26 prélèvements sont négatifs
et 5 des 26 prélèvements sont positifs pour les deux kits, tandis qu’un prélèvement est positif pour le seul kit Roche et
deux pour les seuls réactifs N "série2". En outre, pour 3 prélèvements (20032701, 20032712, 20032714) les quantités
d’ARN détectés sont nettement supérieures avec les réactifs (sondes et amorces) de la série n°2. Ces résultats indiquent
que les amorces et sondes N "série2" sont plus sensibles pour la détection du génome du SARS-CoV dans des prélèvements biologiques que celles du kit actuellement disponible.
Tableau VI: Analyse par RT-PCR en temps réel des ARN extraits d’une série de prélèvements de 5 patients
à l’aide des couples d’amorces et de sondes de la série n° 2 (N "série 2") ou du kit "LightCycler SARS-CoV
quantification kit" (Roche). Le type de prélèvement est indiqué ainsi que le nombre de copies de génome
viral mesurées dans chacun des deux tests. NEG : RT-PCR négative.
Prélèvements n°

Patient

Type de
prélèvement

KIT ROCHE

N "série2"

20033082
20033083
20033086
20033087
20032802
20032803
20032806
20031746ARN2
20032711
20032910
20032911
20033356
20033357
20031725
20032657
20032698
20032720
20033074
20032701
20032702
20031747ARN2

K
K
K
K
M
M
M
C
C
B
B
V
V
K
K
K
K
K
M
M
C

nasal
pharyngé
nasal
pharyngé
nasal
expectoration
nasal ou pharyngé
pharyngé
nasal ou pharyngé
nasal
pharyngé
expectoration
expectoration
asp. endotrachéale
asp. endotrachéale
asp. endotrachéale
asp. endotrachéale
selles
pharyngé
expectoration
pharyngé

NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
39
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
3
115
443
NEG
NEG

NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
150
NEG
NEG
5
257
1676
249
NEG

45

EP 1 694 829 B1
(suite)

5

Prélèvements n°

Patient

Type de
prélèvement

KIT ROCHE

N "série2"

20032712
20032714
20032800
20033353
20033384

C
C
B
V
V

inconnu
pharyngé
nasal
nasal
nasal

634
17
NEG
NEG
NEG

6914
223
NEG
NEG
NEG

10

b) Deuxième étude comparative

15

20

[0289] Les performances de différentes méthodes de RT-PCR nichée et de RT-PCR en temps réel ont ensuite été
comparées pour 121 prélèvements respiratoires de cas possibles de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam,
réalisés entre le 4ème et le 17ème jour après le début des symptômes. Parmi ces prélèvements, 14 avaient été trouvés
positifs lors d’un premier test utilisant la méthode de RT-PCR nichée ciblant l’ORFlb (codant pour la réplicase) telle que
décrite initialement par le Bernhard Nocht Institute (RT-PCR nichée BNI). Des informations concernant ce test sont
disponibles sur internet, à l’adresse http://wwwl5.bni-hamburg.de/bnilbn12/neu2/getfile.acgi?area_engl=diagnostics&pid=4112.
[0290] Les différents tests comparés dans cette étude sont :
-

25

-

30

35

40

45

50

la méthode de RT-PCR quantitative selon l’invention, avec les amorces et sonde N "série 2" décrite ci-dessus
(colonne Light Cycler N),
le test de RT-PCR nichée ciblant le gène de l’ARN polymérase décrit ci-dessus, développé par le CDC, le BNI et
l’Institut Pasteur (RT-PCR nichée CDC/IP),
le kit ARTUS de référence "HPA Corona LC RT-PCR Kit # 5601-02", qui est un test de RT-PCR en temps réel
ciblant le gène ORF1b,
le test de RT-PCR nichée du BNI, ciblant également le gène de l’ARN polymérase, mentionné ci-dessus.

[0291]

Les inventeurs ont constaté :

1) une variabilité inter-test pour une même technique, liée à la dégradation de la préparation d’ARN lors de décongélations répétées, notamment pour les échantillons contenant les quantités d’ARN les plus faibles,
2) une sensibilité réduite de la RT-PCR nichée CDC/IP par rapport à la RT-PCR nichée BNI, et
3) une sensibilité comparable du test de RT-PCR quantitative selon l’invention (Light Cycler N) par rapport au test
Light Cycler (LC) Artus.
[0292] Ces résultats, présentés dans le Tableau VII ci-dessous, montrent que le test par RT-PCR quantitative selon
l’invention constitue un excellent complément - ou une alternative - aux tests actuellement disponibles. En effet, le
coronavirus lié au SRAS est un virus émergent, susceptible d’évoluer rapidement. En particulier, le gène de la RNA
polymérase du coronavirus lié au SRAS, qui est ciblé dans la plupart des tests actuellement disponibles, peut recombiner
avec celui d’autres coronavirus non liés au SRAS. L’utilisation d’un test ciblant exclusivement ce gène pourrait alors
conduire à l’obtention de faux négatifs.
[0293] Le test par RT-PCR quantitative selon l’invention ne cible pas la même région génomique que le kit ARTUS,
puisqu’il cible le gène codant pour la protéine N. En réalisant un test de diagnostique ciblant deux gènes différents du
coronavirus lié au SRAS, on peut donc espérer s’affranchir de résultats de type faux négatifs, qui pourraient être dus à
l’évolution génétique du virus.
[0294] De plus, il apparaît particulièrement avantageux de cibler le gène de la protéine de nucléocapside, car il est
très stable, du fait de la forte pression de sélection liée aux contraintes structurales élevées concernant cette protéine.

55

46

EP 1 694 829 B1
Tableau VII: Comparaison de différentes méthodes d’analyse par amplification génique, à partir de 121
Prélèvements de cas probables de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam (épidémie 2003)
N° CNR

Type
prélèvement
(1)

107
prélèvements

N et P

032529

P

10

032530

N

032531

RT-PCR
nichée
CDC/IP

RT-PCR
nichée
BNI

kit Light
Cycler
Artus

Light
Cycler N
(IP)

Négatif

Négatif

Négatif

Négatif

NHB

Négatif

Positif

Négatif

Négatif

10

NHB

Positif

Positif

3,10E+01

4,20E+01

P

7

LP

Positif

Positif

7,70E+00

3,10E+00

032534

N

15

BND

Positif

Positif

1,60E+00

Négatif

032600

P

4

NHH

Négatif

Positif

Négatif

1,30E+02

032612

P

17

NTS

Négatif

Positif

Négatif

Négatif

032688

P

9

BTX

Positif

Positif

Négatif

Négatif

032689

N

4

NVH

Positif

Positif

1,20E+01

2,30E+02

032690

P

4

NVH

Négatif

Positif

1,60E+00

Négatif

032727

P

8

NVH

Positif

Positif

2,30E+02

4.00E+02

032728

N

8

NVH

Positif

Positif

1,10E+03

1,60E+04

032729

P

14

NHB

Positif

Positif

5,90E+00

3,40E+01

032730

N

14

NHB

Positif

Positif

1,30E+02

4,80E+02

032741

P

8

NHH

Positif

Positif

2,10E+02

1,30E+02

10

14

10

9

71,4%

100,0%

71,4%

64,3%

5

10

15

20

25

Jour
prélèvement

Patient

30

positifs
fraction détectée des 14 positifs
35

(1) P= écouvillonage pharyngé
N= écouvillonage nasal
Exemple 9 : Obtention et caractérisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine N

40

45

50

55

[0295] Des souris Balb C ont été immunisées à l’aide de la protéine N recombinante purifiée et leurs cellules spléniques
fusionnées avec un myélome murin approprié selon les techniques de Köhler et Milstein.
[0296] Dix-neuf hybridomes sécréteurs d’anticorps anti N ont été présélectionnés et leurs immuno réactivités précisées.
Ces anticorps reconnaissent bien la protéine N recombinante (en ELISA) avec des intensités variables, ainsi que la
protéine virale, naturelle N en ELISA et/ou en Western Blot. Les figures 18 à 20 montrent les résultats de ces tests pour
15 de ces 19 anticorps monoclonaux.
[0297] Les clones 12, 17, 28, 57, 72, 76, 86, 87, 98, 103, 146, 156, 166, 170, 199, 212, 218, 219 et 222, fortement
réactifs, ont été sous clonés. Les études de spécificité ont été poursuivies avec les outils appropriés afin de préciser les
épitopes reconnus et vérifier l’absence de réactivité vis-à-vis des autres Coronavirus humains et de certains virus
respiratoires.
[0298] Les études de cartographie (mapping) épitopique (réalisées sur membrane spot, à l’aide de peptides chevauchants de 15 aa) et les études supplémentaires réalisées sur la protéine N naturelle en Western Blot ont révélé l’existence
de 4 groupes d’anticorps monoclonaux :
1° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope linéaire majeur en position N-ter (75-81, séquence : INTNSVP)
Le représentant de ce groupe est l’anticorps 156. L’hybridome produisant cet anticorps a été déposé à la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l’Institut Patseur (Paris, France) le 1er décembre 2004, sous
le numéro I-3331. Ce même épitope est également reconnu par un sérum de lapin (polyclonal anti N) obtenu par
immunisation classique à l’aide de cette même protéine N.

47

EP 1 694 829 B1
2° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope linéaire majeur situé en position centrale (position 217-224,
séquence : ETALALL); les représentants de ce groupe sont les anticorps monoclonaux 87 et 166. L’hybridome
produisant l’anticorps 87 a été déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3328.
3° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope linéaire majeur situé en position C-terminale (position 403-408,
séquence : DFFRQL), les représentants de ce groupe sont les anticorps 28, 57 et 143. L’hybridome produisant
l’anticorps 57 a été déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3330.
4° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope discontinu, conformationel. Ce groupe d’anticorps ne reconnaît
aucun des peptides recouvrant la séquence de la protéine N, mais réagissent fortement sur la protéine naturelle
non dénaturée. Le représentant de ce dernier groupe est l’anticorps 86. L’hybridome produisant cet anticorps a été
déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3329.

5

10

[0299]

Le Tableau VIII ci-après résume les résultats de cartographie épitopique obtenus :
Tableau VIII : Mapping épitopique des anticorps monoclonaux

15

20

25

30

35

40

45

50

Anticorps

Epitope

Position

Région

28

DFSRQL Q

403 ... 408

C-Ter.

143

DFSRQL Q

76

DFSRQL Q

57

DFSRQL Q

FFGMS RI

315 .... 319

146

LPQRQ

383...387

166

ETALALLLL

217 ...224

87

ETALALL

217... 224

156

INTNSGP

75... 81

86

Conformationnel

212

Conformationel

170

Conformationnel

centrale

N - Ter.

[0300] En outre, comme illustré notamment aux figures 18 et 19, ces anticorps ne présentent pas de réactivité en
ELISA et/ou en WB, vis à vis de la protéine N du coronavirus humain 229 E.
Exemple 10 : Combinaisons des anticorps monoclonaux pour le développement d’un test d’immunocapture
sensible et spécifique de l’antigène viral N dans le sérum ou les fluides biologiques des patients contaminés
par le virus SARS Co V
[0301] Les anticorps listés ci-dessous ont été retenus en raison de leurs propriétés bien particulières pour une étude
supplémentaire de capture et détection de la protéine virale N, dans le sérum des sujets ou patients.
[0302] Ces anticorps ont été produits en ascite sur souris, purifiés par chromatographie d’affinité et utilisés seuls ou
en combinaison comme anticorps de capture, et comme anticorps signal.
[0303] Liste des anticorps sélectionnés pour le propos :
-

Acm anti région C-ter (n° 28, 57, 143)
Acm anti région centrale (n° 87, 166)
Acm anti région N-ter (n° 156)
Acm anti épitope discontinu, conformationnel (86)

1) Préparation des réactifs :
55

a) Plaques ELISA immunocapture
[0304]

Les plaques sont sensibilisées avec les solutions d’anticorps à 5 Pg/ml en tampon carbonate 0,1 M, pH.9,6.

48

EP 1 694 829 B1
Les solutions (monovalentes ou plurivalentes) sont déposées sous volume de 100 Pl dans les puits et incubées pendant
une nuit à température ambiante. Ces plaques sont ensuite lavées en tampon PBS (10 mM pH 7,4 additionné de 0,1%
de Tween 20) puis saturées avec une solution de PBS additionnée de 0,3% de BSA et de 5% de Saccharose). Les
plaques sont ensuite séchées puis conditionnées dans un sachet en présence d’un dessicant. Elles sont prêtes à l’emploi.
5

b) Conjugués

10

[0305] Les anticorps purifiés ont été couplés à la péroxydase selon le protocole de Nakane (Nakane et al. - 1974, J.of
Histo and cytochemistry, vol.22, p1084-1091) dans un rapport de une molécule d’IgG pour 3 molécules de péroxydase.
Ces conjugués ont été purifiés par chromatographie d’exclusion et conservés concentrés (concentration comprise entre
1 à 2 mg/ml) en présence de 50% de glycerol et à -20°C. Ils sont dilués pour leur mise en oeuvre dans les essais à la
concentration finale de 1 ou 2 Pg/ml en tampon PBS (pH 7,4) additionné de 1% de BSA.
c) Autres réactifs

15

[0306]

20

-

25

-

30

35

40

45

50

55

Sérums humains négatifs pour tous les marqueurs sériques des virus HIV, HBV, HCV et THLV
Pool de sérums humains négatifs additionné de 0,5% de Triton X 100
Ag viral inactivé : surnageant de culture virale inactivé par irradiation et inactivation vérifiée après mise en culture
sur cellules sensibles - titre de la suspension avant inactivation environ 107 particules infectieuses par ml ou encore
environ 5x109 particules virales physiques par ml d’antigène
Les échantillons d’Ag dilués en sérum humain négatif : ces échantillons ont été préparés par dilution au 1:100e puis
par dilution en série de raison 5.
Ces échantillons non infectieux miment des échantillons humains supposés contenir des concentrations faibles à
très faibles de nucléoprotéine virale N. De tels échantillons ne sont pas accessibles pour les travaux de routine
Solution de lavage R2, solution de révélation TMB R8, chromogène R9 et solution d’arrêt R10, sont les réactifs
génériques commercialisés par Bio-Rad dans ses trousses ELISA (ex : trousse Platelia Pylori ref.72778).

2) Mode opératoire
[0307] Les échantillons de sérums humains surchargés en Ag viral inactivé sont distribués à raison de 100 Pl par
cupule, directement dans les plaques sensibilisées, prêtes à l’emploi puis incubés pendant 1 heure à 37°C (incubation
Bio-Rad IPS).
[0308] Le matériel non retenu par la phase solide est éliminé par 3 lavages (lavage avec solution R2 diluée, laveur
automatique LP 35).
[0309] Les conjugués appropriés, dilués à la concentration finale de 1 ou 2 Pg/ml sont distribués à raison de 100 Pl
par cupule et les plaques incubées à nouveau pendant une heure à 37° C (incubation IPS).
[0310] L’excès de conjugué est éliminé par 4 lavages successifs (solution R2 diluée - laveur LP 35).
[0311] La présence de conjugué fixé sur les plaques est révélée après addition de 100 Pl de solution de révélation
préparée avant emploi (1 ml de R9 et 10 ml de R8) et après incubation pendant 30 minutes, à température ambiante et
à l’abri de la lumière.
[0312] La réaction enzymatique est finalement bloquée par addition de 100 Pl de réactif R10 (H2SO4 IN) dans toutes
les cupules.
[0313] La lecture est effectuée à l’aide d’un lecteur de microplaque approprié à double longueur d’onde (450/620 nm).
[0314] Les résultats peuvent être interprétés en utilisant comme valeur seuil provisoire la moyenne d’au moins deux
contrôles négatifs multiplié par un facteur 2 ou encore la moyenne de 100 sérums négatifs additionnée d’un incrément
correspondant à 6 SD (Standart Deviation calculée sur les 100 mesures individuelles).
3) Résultats
[0315] Différentes combinaisons anticorps de capture et anticorps signal ont été testées en se fondant sur les propriétés
des anticorps sélectionnés, et en évitant les combinaisons d’anticorps spécifiques des mêmes épitopes en phase solide
et en conjugués.
[0316] Les meilleurs résultats ont été obtenus avec les 4 combinaisons listées ci-dessous. Ces résultats sont reproduits
dans le tableau IX ci-après.
1. Combinaison F/28

49

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5

10

15

20

Phase solide (Acm 166 + 87 région centrale) : conjugué anticorps 28 (C-ter)
2. Combinaison G/28
Phase solide (Acm 86 - épitope conformationel) : conjugué anticorps 28 (C-ter)
3. Combinaison H/28
Phase solide (Acms 86, 166 et 87 région centrale et épitope conformationel) : conjugué anticorps 28 (C-ter)
4. Combinaison H/28 + 87
Phase solide (Acms 86, 166 et 87 région centrale et épitope conformationel) : conjugué mixte anticorps 28 (C-ter)
et 87 (central)
5. Combinaison G/87
Phase solide (Acm 86 - épitope conformationel) : conjugué anticorps 87 (région centrale)
Les 4 premières combinaisons présentent des performances équivalentes et reproduites, supérieures aux autres
combinaisons mises en oeuvre (comme par exemple la combinaison G/87). Bien entendu, dans ces combinaisons,
un anticorps monoclonal peut être remplacé par un autre anticorps reconnaissant le même épitope. Ainsi, on peut
citer les variantes suivantes :
6. Variante de la combinaison F/28
Phase solide (Acm 87 uniquement) : conjugué anticorps 57 (C-ter)
7. Variante de la combinaison G/28
Phase solide (Acm 86 - épitope conformationel) : conjugué anticorps 57 (C-ter)
8. Variante de la combinaison H/28
Phase solide (Acms 86 et 87 région centrale et épitope conformationel) : conjugué anticorps 57 (C-ter)
9. Variante de la combinaison H/28 + 87
Phase solide (Acms 86 et 87 région centrale et épitope conformationel) : conjugué mixte anticorps 57 (C-ter) et 87
(central)

25

Tableau IX : Contrôle d’immunoréactivité des Acm anti nucléoprotéines SARS CoV : densités optiques mesurées
avec chaque combinaison d’anticorps, en fonction des dilutions de l’antigène viral inactivé.

30

35

40

45

50



Dilution

F/28

G/28

G/87

H/28

H/28+87

0
1
2
3
4
5
6
7

1/100
1/500
‘ 500
1/12500
1/62500
1/312500
Témoin
Témoin

5
3, 795
2,815
0,987
0,404
0,285
0,210
0,269

5
3,814
2,950
1,038
0,348
0,211
0,200
0,153

3,495
1,379
0,275
0,135
0,125
0,123
0,098
0,104

3,900
3,702
3,268
1,374
0,480
0,240
0,186
0,193

5
3,804
2,680
0,865
0,328
0,215
0,156
0,202

[0317] La limite de détection de ces 4 essais expérimentaux correspond à la dilution d’antigène en sérum négatif 1:
62500. Une extrapolation rapide laisse supposer la détection de moins de 103 particules infectieuses par ml de sérums.
[0318] De cette étude, il ressort que les anticorps les mieux appropriés pour la capture de la nucleoprotéine virale
native sont les anticorps spécifiques de la région centrale et/ou d’un épitope conformationnel, l’un et l’autre étant des
anticorps sélectionnés également pour leur forte affinité pour l’antigène natif.
[0319] Ayant déterminé les meilleurs anticorps pour la composition de la phase solide, les anticorps à retenir en priorité
pour la détection des antigènes fixés sur la phase solide, sont les anticorps complémentaires spécifiques d’un épitope
dominant en région C-ter. L’emploi de tout autre anticorps complémentaire, mais spécifique des épitopes localisés en
région N-ter de la protéine conduit à des résultats moyens ou médiocres.
Exemple 11 : Systèmes d’expression eucaryotes de la proteine de spicule (S) du coronavirus associé au SRAS
(SRAS-CoV)
1) Optimisation des conditions d’expression de la S du SRAS-CoV en cellules de mammifères.

55

[0320] Les conditions d’expression transitoire de la protéine de spicule (S) du SRAS-CoV ont été optimisées en cellules
de mammifères (293T, VeroE6).
[0321] Pour cela, un fragment d’ADN contenant le cDNA de la S du SRAS-CoV a été amplifié par PCR à l’aide des

50




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