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EP 1 694 829 B1

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plasmide pCR®2.1-TOPO (Invitrogen) pour obtenir le plasmide pTOPO-S-MV. Les deux oligonucléotides utilisés contiennent des sites de restriction BsiW1 et BssHII, de façon à permettre l’insertion ultérieure dans le vecteur rougeole,
et ont été conçus de façon à générer une séquence de 3774 nt incluant les codons d’initiation et de terminaison, afin
de respecter la règle des 6 qui stipule que la longueur du génome d’un virus rougeole doit être divisible par 6 (Calain &
Roux, 1993, J. Virol., 67 : 4822-4830 ; Schneider et al., 1997, Virology, 227 : 314-322). L’insert a été séquencé à l’aide
d’un kit BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) et d’un séquenceur automatique ABI377.
[0405] Afin d’exprimer une forme soluble et sécrétée de la S du SRAS-CoV, un plasmide contenant l’ADNc du polypeptide Ssol correspondant à l’ectodomaine (aa 1-1193) de la S du SRAS-CoV fusionné en son extrémité C-ter à la
séquence d’une étiquette FLAG (DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG a ensuite été obtenu.
Pour cela, un fragment d’ADN a été amplifié à l’aide des oligonucléotides 5’-CCATTTCAAC AATTTGGCCG-3’ et 5’ATAGGATCCG CGCGCTCATT ATTTATCGTC GTCATCTTTA TAATC-3’ à partir du plasmide pCDNA-Ssol puis inséré
dans le plasmide pTOPO-S-MV entre les sites Sall et BamH1 pour obtenir le plasmide pTOPO-S-MV-SF. La séquence
générée est longue de 3618 nt entre les sites BsiW1 et BssHII et respecte la règle des 6. L’insert a été séquencé comme
indiqué ci-dessus.
[0406] Les fragments BsiW1-BssHII contenant les ADNc de la protéine S et du polypeptide Ssol ont ensuite été excisés
par digestion des plasmides pTOPO-S-MV et pTOPO-S-MV-SF puis sous-clonés entre les sites correspondants du
plasmide pTM-MVSchw-ATU2 pour donner les plasmides pTM-MVSchw2-SARS-S et pTM-MVSchw2-SARS-Ssol (figure 40B). Ces deux plasmides ont été déposés à la C.N.C.M. le 1er décembre 2004, sous les numéros I-3326 et I3327, respectivement.
[0407] Les virus rougeole recombinants correspondants aux plasmides pTM-MVSchw2-SARS-S et pTM-MVSchw2SARS-Ssol ont été obtenus par génétique inverse selon le système reposant sur l’utilisation d’une lignée cellulaire
auxiliaire, décrit par Radecke et coll. (1995, Embo J., 14, : 5773-5784) et modifié par Parks et coll. (1999, J. Virol., 73 :
3560-3566). Brièvement, les cellules auxiliaires 293-3-46 sont transfectées selon la méthode au phosphate de calcium
par 5 Pg des plasmides pTM-MVSchw2-SARS-S ou pTM-MVSchw2-SARS-Ssol et 0,02 Pg du plasmide pEMC-La
dirigeant l’expression de la polymérase L du MV (don de M.A. Billeter). Après une nuit d’incubation à 37°C, un choc
thermique est réalisé pendant 2 heures à 43°C et les cellules transfectées sont transférées sur une monocouche de
cellules Vero. Pour chacun des deux plasmides, des syncytia sont apparus après 2 à 3 jours de co-culture et ont été
transférés successivement sur des monocouches de cellules Vero à 70% de confluence en boites de pétri de 35 mm
puis en flacons de 25 et 75 cm2. Quand les syncytia ont atteint 80-90% de confluence, les cellules sont récupérées à
l’aide d’un grattoir puis congelées et décongelées une fois. Après une centrifugation à basse vitesse, le surnageant
contenant le virus est conservé en aliquot à -80°C. Les titres des virus recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2SARS-Ssol ont été déterminés par dilution limite sur cellules Vero et le titre en dose infectant 50% des cupules (TCID50)
calculé selon la méthode de Kärber.
3) Caractérisation des virus recombinants
[0408] L’expression des transgènes codant la protéine S et le polypeptide Ssol a été recherchée par western blot et
immunofluorescence.
[0409] Des monocouches de cellules Vero en flacons T-25 ont été infectées à une multiplicité de 0,05 par différents
passages des deux virus MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol et le virus sauvage MWSchw à titre de contrôle.
Quand les syncytia ont atteint 80 à 90% de confluence, des extraits cytoplasmiques ont été préparés dans un tampon
d’extraction (150mMNaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1% triton-X-100, 0,1% SDS, 1% DOC) puis dilués en tampon de
dépôt selon Laemmli, séparés sur un gel SDS à 8% de polyacrylamide et transférés sur une membrane de PVDF
(BioRad). La détection de cette immunoempreinte (« western blot») a été réalisée à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin
anti-S (immun-sérum du lapin P11135 : cf exemple 4 ci-dessus) et d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les IgG
de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés par luminescence à l’aide
du kit ECL+ (Amersham) et de films d’autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham).
[0410] Des cellules Vero en monocouches sur lamelles de verre ont été infectées par les deux virus MVSchw2-SARSS et MVSchw2-SARS-Ssol et le virus sauvage MWSchw à titre de contrôle à des multiplicités d’infection de 0,05. Quand
les syncytia ont atteint 90 à 100% (virus MVSchw2-SARS-Ssol) ou 30 à 40% (MVSchw2-SARS-S,MWSchw) de confluence, les cellules ont été fixées dans une solution de PBS-PFA 4%, perméabilisées par une solution de PBS contenant
0,2% de triton puis marquées par des anticorps polyclonaux de lapins hyperimmunisés par des virions purifiés et inactivés
du SRAS-CoV et par un conjugué d’anticorps de chèvre anti-IgG(H+L) de lapin couplé au FITC (Jackson).
[0411] Comme le montrent les figures 41 et 42, les virus recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol
dirigent l’expression de la protéine S et du polypeptide Ssol respectivement à des niveaux comparables à ceux que l’on
peut observer 8h après infection par le SRAS-CoV. L’expression de ces polypeptides est stable après 3 passages des
virus recombinants en culture cellulaire. Ces résultats démontrent que les virus rougeole recombinants sont bien porteurs
des transgènes et permettent l’expression de la glycoprotéine du SRAS sous sa forme membranaire (S) ou sous une

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