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EP 1 694 829 B1

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qui sont comparables à ceux que l’on peut observer 8h après infection par le SRAS-CoV mais qui sont bien plus élevés
que ceux que l’on peut observer après infection par W-TG-S. Dans une deuxième expérience (figure 35B), l’analyse de
quantités variables d’extraits cellulaires montre que les niveaux d’expression observés après infection par les virus de
la série TN (VV-TN-S et VV-TN-Ssol) sont environ 10 fois plus élevés que ceux observés avec les virus de la série TG
(VV-TG-S et VV-TG-Ssol respectivement). En outre, le polypeptide Ssol est sécrété dans le surnageant de cellules CV1 infectées par le virus VV-TN-Ssol plus efficacement que dans le surnageant de cellules infectées par VV-TG-Ssol
(figure 36A). Dans cette expérience, le virus VV-TN-Sflag a été utilisé à titre de contrôle, car il exprime la forme membranaire de la protéine S fusionnée en son extrémité C-ter à l’étiquette FLAG. La protéine Sflag n’est pas détectée dans
le surnageant des cellules infectées par VV-TN-Sflag, démontrant que le polypeptide Ssol est bien sécrété de façon
active après infection par VV-TN-Ssol.
[0383] Ces résultats démontrent que les virus vaccine recombinants sont bien porteurs des transgènes et permettent
l’expression de la glycoprotéine du SRAS sous sa forme membranaire (S) ou sous une forme soluble et sécrétée (Ssol).
Les virus vaccine porteurs du promoteur synthétique 480 permettent l’expression de S et la sécrétion de Ssol à des
niveaux bien plus élevés que les virus porteurs du promoteur du gène 7.5K.

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4) Application à la production d’une forme soluble de la S du SRAS-CoV. Purification de cet antigène recombinant et applications diagnostiques.

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[0384] La lignée BHK-21 est la lignée cellulaire qui sécrète les quantités les plus élevées de polypeptide Ssol après
infection par le virus VV-TN-Ssol parmi les lignées testées (BHK-21, CV1, 293T et FrhK-4, figure 36B); elle permet la
production et la purification en quantité du polypeptide recombinant Ssol. Dans une expérience type où les conditions
expérimentales d’infection, de production et de purification ont été optimisées, les cellules BHK-21 sont ensemencées
en milieu de culture standard (DMEM sans pyruvate contenant 4.5g/l de glucose et supplémenté par 5% de TPB, 5%
de SVF, 100 U/ml de pénicilline et 100 Pg/ml de streptomycine) sous la forme d’une monocouche sous-confluente (10
millions de cellules pour chaque 100 cm2 dans 25 ml de milieu). Après 24h d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, les
cellules sont infectées à une M.O.I. de 0.03 et le milieu standard remplacé par le milieu de sécrétion où la quantité de
SVF est abaissée à 0.5% et le TPB supprimé. Le surnageant de culture est prélevé après 2,5 jours d’incubation à 35°C
et sous 5% de CO2 et le virus de la vaccine inactivé par addition de triton X-100 (0,1%). Après filtration sur membrane
de polyethersulfone (PES) de 0.1 Pm, le polypeptide recombinant Ssol est purifié par une chromatographie d’affinité
sur matrice anti-FLAG avec élution par une solution de peptide FLAG (DYKDDDDK) à 100 Pg/ml en TBS (Tris 50mM
pH 7.4, 150 mMNaCl).
[0385] L’analyse par gel SDS à 8 % d’acrylamide coloré au nitrate d’argent a mis en évidence un polypeptide majoritaire
dont la masse moléculaire est d’environ 180kD et dont le degré de pureté est supérieur à 90% (figure 37).La concentration
du polypeptide recombinant Ssol purifié a été déterminée par comparaison avec les marqueurs de masse moléculaire
et estimée à 24 ng/Pl.
[0386] Cette préparation de polypeptide Ssol purifié permet de réaliser une gamme étalon pour mesurer à l’aide d’un
test ELISA-capture les concentrations de Ssol présentes dans les surnageants de culture. Selon ce test, la lignée BHK21 sécrète environ 1 Pg/ml de polypeptide Ssol dans les conditions de production décrites plus haut. En outre, le schéma
de purification présenté permet de purifier de l’ordre de 160 Pg de polypeptide Ssol par litre de surnageant de culture.
[0387] La réactivité en ELISA du polypeptide recombinant Ssol a été analysée vis-à-vis de sérums de patients atteints
de SRAS.
[0388] Les sérums de cas probables de SRAS testés ont été choisis sur la base des résultats (positifs ou négatifs)
d’analyse de leur réactivité spécifique vis à vis des antigènes natifs du SRAS-CoV par test d’immunofluorescence sur
cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV et/ou par test ELISA indirect en utilisant comme antigène un lysat de cellules
VeroE6 infectées par le SRAS-CoV. Les sérums de ces patients sont identifiés par un numéro d’ordre du Centre National
de Référence des Virus Influenzae ainsi que par les initiales du patient et le nombre de jours écoulés depuis le début
des symptômes. Tous les sérums de cas probables (cf Tableau XVI) reconnaissent les antigènes natifs du SRAS-CoV
à l’exception du sérum 032552 du patient VTT, pour lequel l’infection par le SRAS-CoV n’a pas pu être confirmée par
RT-PCR réalisée sur prélèvements respiratoires des jours 3, 8 et 12. Un panel de sérums témoin a été utilisé à titre de
contrôle (sérums TV): il s’agit de sérums prélevés en France avant l’épidémie de SRAS survenue en 2003.
Tableau XVI : sérums de cas probables de SRAS

55

sérum

patient

jour de prélèvement

033168

JYK

38

033597

JYK

74

032632

NTM

17

61