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EP 1 694 829 B1

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[0374] Les différentes formes du gène S ont été placées sous la dépendance du promoteur du gène 7.5K puis introduites
au sein du locus de la thymidine kinase (TK) de la souche Copenhague du virus de la vaccine par double recombinaison
homologue in vivo. Afin d’améliorer l’immunogénicité des virus vaccine recombinants, un promoteur tardif synthétique
a été choisi à la place du promoteur 7.5K, pour augmenter la production de S et Ssol au cours des phases tardives du
cycle viral.
[0375] Après avoir isolé les virus vaccine recombinants et vérifié leur capacité à exprimer l’antigène S du SRAS-CoV,
leur capacité à induire chez la souris une réponse immunitaire contre le SRAS a été testée. Après avoir purifié l’antigène
Ssol du surnageant de cellules infectées, un test ELISA de sérodiagnostic du SRAS a été conçu, et son efficacité a été
évaluée à l’aide de sérums de cas probables de SRAS.

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2) Construction des virus recombinants

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[0376] Des virus recombinants de la vaccine dirigeant l’expression de la glycoprotéine S de l’isolat 031589 du SRASCoV et d’une forme soluble et sécrétée de cette protéine, le polypeptide Ssol, sous la dépendance du promoteur 7.5K
ont été obtenus. Dans le but d’augmenter les niveaux d’expression de S et Ssol, des virus recombinants dans lesquels
les cDNA de S et de Ssol sont placés sous la dépendance d’un promoteur synthétique tardif ont également été obtenus.
[0377] Le plasmide pTG186poly est un plasmide de transfert pour la construction de virus recombinants de la vaccine
(Kieny, 1986, Biotechnology, 4 :790-795). A ce titre, il contient le gène de la thymidine kinase du VV dans lequel a été
inséré le promoteur du gène 7.5K suivi d’un site multiple de clonage permettant l’insertion de gènes hétérologues (figure
34A). Le promoteur du gène 7.5K contient en fait un tandem de deux séquences promotrices actives respectivement
durant les phases précoces (PE) et tardives (PL) du cycle de réplication du virus de la vaccine. Les fragments BamH1Xho1 ont été excisés des plasmides pTRIP-S et pcDNA-Ssol respectivement et insérés entre les sites BamH1 et Sma1
du plasmide pTG186poly pour donner les plasmides pTG-S et pTG-Ssol (figure 34A). Les plasmides pTG-S et pTGSsol ont été déposés à la CNCM, le 2 décembre 2004, sous les numéros I-3338 et 1-3339, respectivement.
[0378] Les plasmides pTN480, pTN-S et pTN-Ssol ont été obtenus à partir des plasmides pTG186poly, pTG-S et
pTG-Ssol respectivement, en substituant le fragment Nde1-Pst1 contenant le promoteur 7.5K par un fragment d’ADN
contenant le promoteur tardif synthétique 480, qui a été obtenu par hybridation des oligonucléotides 5’- TATGAGCTTT
TTTTTTTTTT TTTTTTTGGC ATATAAATAG ACTCGGCGCG CCATCTGCA-3’ et 5’- GATGGCGCGC CGAGTCTATT
TATATGCCAA AAAAAAAAAA AAA.AAAAAGC TCA-3’ (figure 34B). L’insert a été séquencé à l’aide d’un kit BigDye
Terminator v1.1 (Applied Biosystems) et d’un séquenceur automatique ABI377. La séquence du promoteur synthétique
tardif 480 tel que cloné dans les plasmides de transfert de la série pTN est indiquée figure 34C. Les plasmides pTN-S
et pTN-Ssol ont été déposés à la CNCM, le 2 décembre 2004, sous les numéros I-3340 et I-3341, respectivement.
[0379] Les virus recombinants de la vaccine ont été obtenus par double recombinaison homologue in vivo entre la
cassette TK des plasmides de transfert des séries pTG et pTN et le gène TK de la souche Copenhague du virus de la
vaccine selon une procédure décrite par Kieny et coll. (1984, Nature, 312: 163-166). Brièvement, des cellules CV-1 sont
transfectées à l’aide de DOTAP (Roche) par de l’ADN génomique de la souche copenhague du virus de la vaccine et
chacun des plasmides de transfert des séries pTG et pTN décrits ci-dessus, puis surinfectées par le virus vaccine
auxiliaire VV-ts7 pendant 24 heures à 33°C. Le virus auxiliaire est contre-sélectionné par incubation à 40°C pendant 2
jours puis les virus recombinants (phénotype TK-) sélectionnés par deux cycles de clonage sous milieu gélosé sur
cellules 143Btk- en présence de BuDr (25 Pg/ml). Les 6 virus VV-TG, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S et VVTN-Ssol ont été respectivement obtenus à l’aide des plasmides de transfert pTG186poly, pTG-S, pTG-Ssol, pTN480,
pTN-S, pTN-Ssol. Les virus VV-TG et VV-TN n’expriment aucun gène hétérologue et ont été utilisés comme contrôle
TK- dans les expériences. Les préparations de virus recombinants ont été réalisés sur monocouches de cellules CV-1
ou BHK-21 et le titre en unités formant plage (u.f.p.) déterminé sur cellules CV-1 selon Earl et Moss (1998, Current
Protocols in Molecular Biology, 16.16.1-16.16.13).
3) Caractérisation des virus recombinants

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[0380] L’expression des transgènes codant la protéine S et le polypeptide Ssol a été recherchée par western blot.
[0381] Des monocouches de cellules CV-1 ont été infectées à une multiplicité de 2 par les différents virus vaccine
recombinants VV-TG, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S et VV-TN-Ssol. Après 18 heures d’incubation à 37°C
et sous 5% de CO2, des extraits cellulaires ont été préparés en tampon de dépôt selon Laemmli, séparés sur un gel
SDS à 8% de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de PVDF (BioRad). La détection de cette immunoempreinte (« western blot ») a été réalisée à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S (immun-sérum du lapin P11135 :
cf exemple 4) et d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les IgG de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V,
Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés par luminescence à l’aide du kit ECL+ (Amersham) et de films d’autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham).
[0382] Comme le montre la figure 35A, le virus recombinant VV-TN-S dirige l’expression de la protéine S à des niveaux

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