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EP 1 694 829 B1
Tableau XV : utilisation d’un gène synthétique pour l’expression du polypeptide Ssol. Les surnageants ont
été récoltés 48 heures après transfection de cellules BHK ou 293T par les plasmides pCI, pCI-Ssol, pCI-Ssol-CTE,
pCI-Ssol-WPRE et pCI-Scube et analysés de façon quantitative pour la sécrétion du polypeptide Ssol par un test
ELISA-capture spécifique du polypeptide Ssol. Les transfections ont été réalisées en dupliqués et les résultats sont
indiqués sous la forme de moyennes et écart-types des concentrations de polypeptide Ssol (ng/ml) mesurées dans
les surnageants.

5

10

15

20

Plasmide

BHK

293T

Pci

< 20

< 20

pCI-Ssol

< 20

56  10

pCI-Ssol-CTE

< 20

63  8

pCI-Ssol-WPRE

28  1

531  15

PCI-Scube

152  6

1140  20

[0370] En résumé, ces résultats montrent que l’expression dans des cellules de mammifères du gène synthétique
040530 codant pour la S du SRAS-CoV sous la dépendance de séquences promotrices de l’ARN polymérase II est bien
plus efficace que celle du gène sauvage de l’isolat 031589. Cette expression est même plus efficace que celle dirigée
par le gène sauvage en présence des séquences WPRE du virus de l’hépatite de la marmotte.
4) Applications

25

[0371] L’utilisation du gène synthétique 040530 codant pour la S du SRAS-CoV ou de sa variante Scube codant pour
le polypeptide Ssol est susceptible de remplacer avantageusement le gène sauvage dans de nombreuses applications
où l’expression de la S est nécessaire à des niveaux élevés. En particulier pour :
-

30

35

-

améliorer l’efficacité de l’immunisation génique par des plasmides du type pCI-Ssynth voire pCI-Ssynth-CTE ou
pCI-Ssynth-WPRE
établir de nouvelles lignées cellulaires exprimant des quantités plus élevées de la protéine S ou du polypeptide Ssol
à l’aide de vecteurs lentiviraux recombinants porteurs du gène Ssynth ou du gène Scube respectivement
améliorer l’immunogénicité des vecteurs lentiviraux recombinants permettant l’expression de la protéine S ou du
polypeptide Ssol
améliorer l’immunogénicité de vecteurs vivants permettant l’expression de la protéine S ou du polypeptide Ssol
comme des virus recombinants de la vaccine ou des virus rougeole recombinants (voir exemples 16 et 17 ci-après)

Exemple 16 : Expression de la protéine de spicule (S) du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV) à l’aide
de virus recombinants de la Vaccine.
40

Application vaccinale.
Application à la production d’une forme soluble de la protéine de spicule (S) et conception d’un test de sérologie
du SRAS.
45

1) Introduction

50

55

[0372] Le but de cet exemple est d’évaluer la capacité de virus recombinants de la vaccine (VV) exprimant différents
antigènes du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV) à constituer de nouveaux candidats vaccins contre le SRAS
et un moyen de produire des antigènes recombinants en cellules de mammifères.
[0373] Pour cela, les inventeurs se sont intéressés à la protéine de spicule (S) du SRAS-CoV, qui permet d’induire
après immunisation génique chez l’animal des anticorps neutralisants l’infectivité du SRAS-CoV, ainsi qu’à une forme
soluble et sécrétée de cette protéine, le polypeptide Ssol, qui est composé de l’ectodomaine (aa 1-1193) de la S fusionné
en son extrémité C-ter à une étiquette FLAG (DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG. Ce polypeptide
Ssol présente une antigénicité similaire à celle de la protéine S et permet, après injection à la souris sous la forme d’une
protéine purifiée adjuvée en hydroxide d’aluminium, l’induction de titres élevés d’anticorps neutralisants contre le SRASCoV.

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