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EP 1 694 829 B1
pCI-Ssol, pCI-Ssol-CTE et pCI-Ssol-WPRE (déposé à la CNCM, le 22 novembre 2004, sous le numéro I-3324) avaient
été précédemment obtenus par sous-clonage du fragment Kpn1-Xho1 excisé du plasmide pcDNA-Ssol (voir note technique de la DI 2004-106) entre les sites Nhe1 et Xho1 des plasmides pCI, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE respectivement.)
[0363] Les plasmides pCI-Scube et pCI-Ssol codent pour le même polypeptide recombinant Sso1.
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3) Résultats
10
15
20
25
30
[0364] La capacité du gène synthétique codant pour la protéine S à diriger efficacement l’expression de la S du SRASCoV dans des cellules de mammifères a été comparée à celle du gène sauvage après transfection transitoire de cellules
de primates (VeroE6) et de cellules humaines (293T).
[0365] Dans l’expérience présentée par la figure 33 et au Tableau XIV, des monocouches de 5x105 cellules VeroE6
ou 7x105 cellules 293T en boites de Pétri de 35mm ont été transfectées avec 2 Pg des plasmides pCI (à titre de contrôle),
pCI-S, pCI-S-CTE, pCI-S-WPRE et pCI-Ssynth et 6 Pl de réactif Fugene6 selon les indications du fabricant (Roche).
Après 48 heures d’incubation à 37°C et sous 5% de CO2, des extraits cellulaires ont été préparés en tampon de dépôt
selon Laemmli, séparés sur un gel SDS à 8% de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de PVDF (BioRad).
La détection de cette immunoempreinte (« western blot ») a été réalisée à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S
(immun-sérum du lapin P11135 : cf exemple 4 ci-dessus) et d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les IgG de
lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). L’immunoempreinte est révélée de façon quantitative par luminescence à l’aide du kit ECL+ (Amersham) et acquisition sur un dispositif d’imagerie numérique (FluorS, BioRad).
[0366] L’analyse des résultats obtenus avec le logiciel QuantityOne v4.2.3 (BioRad) montre que dans cette expérience,
le plasmide pCI-Synth permet l’expression transitoire de la protéine S à des niveaux élevés dans les cellules VeroE6
et 293T, alors que le plasmide pCI-S ne permet pas d’induire une expression à des niveaux suffisants pour être détectée.
Les niveaux d’expression observés sont de l’ordre de 2 fois supérieurs à ceux observés avec le plasmide pCI-S-WPRE.
Tableau XIV : utilisation d’un gène synthétique pour l’expression de la S du SRAS-CoV. Des extraits cellulaires
préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6 ou 293T par les plasmides pCI, pCI-S, pCI-S-CTE, pCI-SWPRE et pCI-Ssynth ont été séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide d’un
anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V,
Amersham). Le western blot est révélé par luminescence (ECL+, Amersham) et acquisition sur un dispositif d’imagerie
numérique (FluorS, BioRad). Les niveaux d’expression de la protéine S ont été mesurés en quantifiant les 2 bandes
majoritaires repérées sur l’image (voir figure 33) et sont indiqués en fonction d’une échelle arbitraire où la valeur de
1 représente le niveau mesuré après transfection du plasmide pCI-S-WPRE.
plasmide
35
VeroE6
293T
0,0
0,0
≤ 0,1
≤ 0,1
pCI-S-CTE
0,5
≤ 0,1
pCI-S-WPRE
1,0
1,0
PCI-Ssynth
1,8
1,9
pCI
pCI-S
40
45
50
[0367] Dans un second temps, la capacité du gène synthétique Scube à diriger efficacement la synthèse et la sécrétion
du polypeptide Ssol par des cellules de mammifères a été comparée à celle du gène sauvage après transfection transitoire
de cellules de hamster (BHK-21) et de cellules humaines (293T).
[0368] Dans l’expérience présentée par le Tableau XV, des monocouches de 6x105 cellules BHK-21 et de 7x105
cellules 293T en boites de Pétri de 35mm ont été transfectées avec 2 Pg des plasmides pCI (à titre de contrôle), pCISsol, pCI-Ssol-CTE, pCI-Ssol-WPRE et pCI-Scube et 6 Pl de réactif Fugene6 selon les indications du fabricant (Roche).
Après 48 heures d’incubation à 37°C et sous 5% de CO2, les surnageants cellulaires ont été prélevés et analysés de
façon quantitative pour la sécrétion du polypeptide Ssol par un test ELISA-capture spécifique du polypeptide Ssol.
[0369] L’analyse des résultats montre que, dans cette expérience, le plasmide pCI-Scube permet l’expression du
polypeptide Ssol à des niveaux 8 fois (cellules BHK-21) à 20 fois (cellules 293T) plus élevés que le plasmide pCI-Ssol.
Les niveaux d’expression observés sont de l’ordre de 2 fois (cellules 293T) à 5 fois (cellules BHK-21) supérieurs à ceux
observés avec le plasmide pCI-Ssol-WPRE.
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