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EP 1 694 829 B1
(suite)
groupe
5
Ssol
10
15
sérums
Ac. Neutralisants
pi
< 20
IS1
57
IS2
> 2560
IS3
> 5120
[0354] Les titres neutralisants observés chez les souris immunisées avec le polypeptide Ssol atteignent des niveaux
très supérieurs aux titres observés par Yang et coll. chez la souris (2004, Nature, 428: 561-564) et à ceux observés par
Buchholz chez le hamster (2004, PNAS 101 : 9804-9809), qui protègent respectivement la souris et le hamster de
l’infection par le SRAS-CoV. Il est donc vraisemblable que les anticorps neutralisants induits chez la souris après
immunisation par le polypeptide Ssol protègent ces animaux contre l’infection par le SRAS-CoV.
Exemple 15 : Gène synthétique optimisé pour l’expression en cellules de mammifères de la protéine de spicule
(S) du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV).
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1) Conception du gène synthétique
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[0355] Un gène synthétique codant pour la protéine de spicule du SRAS-CoV a été conçu à partir du gène de l’isolat
031589 (plasmide pSARS-S, C.N.C.M. n° I-3059) de façon à permettre des niveaux d’expression élevés dans des
cellules de mammifères et en particulier dans les cellules d’origine humaine.
[0356] Pour cela :
-
30
-
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40
l’usage des codons du gène sauvage de l’isolat 031589 a été modifié de façon à se rapprocher du biais observé
chez l’homme et à améliorer l’efficacité de traduction du mRNA correspondant
le contenu global en GC du gène a été augmenté de façon à prolonger la demi-vie du mRNA correspondant
les motifs, éventuellement cryptiques, susceptibles d’interférer avec une expression efficace du gène ont été supprimés (sites donneurs et accepteurs d’épissage, signaux de polyadénylation, séquences très riches (>80%) ou
très pauvres (<30%) en GC, séquences répétées, séquences impliquées dans la formation de structures secondaires
de l’ARN, boites TATA)
un deuxième codon STOP a été ajouté pour permettre une terminaison efficace de la traduction.
[0357] En outre, des motifs CpG ont été introduits dans le gène de façon à augmenter son immunogénicité comme
vaccin à ADN. Afin de faciliter la manipulation du gène synthétique, deux sites de restriction BamH1 et Xho1 ont été
placés de part et d’autre de la phase ouverte de lecture de la protéine S, et les sites de restriction BamH1, Xho1, Nhe1,
Kpn1, BspEl et Sal1 ont été évités dans le gène synthétique.
[0358] La séquence du gène synthétique conçu (gène 040530) est donnée en SEQ ID No: 140.
[0359] Un alignement du gène synthétique 040530 avec la séquence du gène sauvage de l’isolat 031589 du SRASCoV déposé à la C.N.CM. sous le numéro I-3059 (SEQ ID NO : 4, plasmide pSRAS-S) est présenté dans la figure 32.
2) Constructions plasmidiques
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[0360] Le gène synthétique SEQ ID No: 140 a été assemblé à partir d’oligonucléotides synthétiques et cloné entre
les sites Kpn1 et Sac1 du plasmide pUC-Kana pour donner le plasmide 040530pUC-kana. La séquence nucléotidique
de l’insert du plasmide 040530pUC-kana a été vérifiée par séquençage automatique (Applied).
[0361] Un fragment Kpn1-Xho1 contenant le gène synthétique 040530 a été excisé du plasmide 040530pUC-kana et
sous-cloné entre les sites Nhe1 et Xho1 du plasmide d’expression pCI (Promega) pour obtenir le plasmide pCI-SSYNTH,
déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3333.
[0362] Un gène synthétique codant pour la forme soluble de la protéine S a ensuite été obtenu en fusionnant les
séquences synthétiques codant pour l’ectodomaine de la protéine S (acides aminés 1 à 1193) à celles de l’étiquette
(FLAG : DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG. Pratiquement, un fragment d’ADN codant pour
l’ectodomaine de la S du SRAS-CoV a été amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 5’-ACTAGCTAGC GGATCCACCA TGTTCATCTT CCTG -3’ et 5’- AGTATCCGGAC TTGATGTACT GCTCGTACTT GC-3’ à partir du plasmide
040530pUC-kana, digéré par Nhe1 et BspEl puis inséré entre les sites uniques Nhe1 et BspEl du plasmide pCI-Ssol,
pour donner le plasmide pCI-SCUBE, déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro 1-3332. (Les plasmides
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