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EP 1 694 829 B1
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[0347] Des phases solides sensibilisées par le polypeptide recombinant Ssol ont été préparées par adsorption d’une
solution de polypeptide Ssol purifié à 2 Pg/ml en PBS dans les puits d’une plaque ELISA, puis les plaques sont incubées
une nuit à 4°C et lavées avec du tampon PBS-Tween (PBS, 0,1% Tween20). Après saturation des plaques ELISA par
une solution de PBS-lait écrémé à 10% (poids/volume) et lavage en PBS-tween, les sérums à tester (100 Pl) sont dilués
au 1/400 dans du tampon PBS-lait écrémé-Tween (PBS, 3% lait écrémé, 0,1% Tween) puis ajoutés dans les puits de
la plaque ELISA sensibilisée. Les plaques sont incubées 1h à 37°C. Après 3 lavages avec du tampon PBS-Tween, le
conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxidase (réf NA933V, Amersham) dilué au 1/4000 dans du tampon PBSlait écrémé-Tween est ajouté, puis les plaques sont incubées une heure à 37°C. Après 6 lavages avec du tampon PBSTween, le chromogène (TMB) et le substrat (H2O2) sont ajoutés et les plaques sont incubées 10 minutes à l’abri de la
lumière. La réaction est arrêtée par ajout d’une solution 1N de H3PO4, puis l’absorbance est mesurée à 450 nm avec
un référence à 620nm.
[0348] Les tests ELISA (figure 30) démontrent que le polypeptide recombinant Ssol est reconnu spécifiquement par
les anticorps sériques de patients atteints de SRAS prélevés en phase moyenne ou tardive de l’infection (≥ 10 jours
après le début des symptômes alors qu’il n’est pas reconnu de façon significative par les anticorps sériques de deux
patients (JLB et JCM) prélevés en phase précoce de l’infection (3 à 8 jours après le début des symptômes) ni par des
sérums témoins de sujets non atteints de SRAS. Les anticorps sériques des patients JLB et JCM montrent une séroconversion entre les jours 3 et 27 pour le premier et 8 et 29 pour le second après le début des symptômes, ce qui
confirme la spécificité de la réactivité de ces sérums vis-à-vis du polypeptide Ssol.
[0349] En conclusion, ces résultats démontrent que le polypeptide recombinant Ssol peut être utilisé comme antigène
pour la mise au point d’un test ELISA de diagnostic sérologique de l’infection par le SRAS-CoV.
Exemple 14 : Applications vaccinales de la protéine S soluble recombinante
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[0350] L’immunogénicité du polypeptide recombinant Ssol a été étudiée chez la souris.
[0351] Pour cela, un groupe de 6 souris a été immunisé à 3 semaines d’intervalle avec 10 Pg de polypeptide recombinant Ssol adjuvé par 1 mg d’hydroxyde d’aluminium (Alu-gel-S, Serva) dilué en PBS. Trois immunisations successives
ont été réalisées et les sérums immuns ont été prélevés 3 semaines après chacune des immunisations (IS1, IS2, IS3).
A titre de contrôle, un groupe de souris (groupe mock) a reçu de l’hydroxide d’aluminium seul selon le même protocole.
[0352] Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des 2 groupes par ELISA indirect en utilisant un
lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme antigène et à titre de contrôle, un lysat de cellules VeroE6
non infectées. Les titres en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO
spécifique de 0,5 après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de souris couplé à la peroxidase (NA931
V, Amersham) et du TMB additionné de H 2O2 (KPL). Cette analyse (figure 31) montre que l’immunisation par le polypeptide Ssol induit chez la souris dès la première immunisation des anticorps dirigés contre la forme native de la protéine
de spicule du SRAS-CoV présente dans le lysat de cellules VeroE6 infectées. Après 2 puis 3 immunisations, les titres
en anticorps anti-S deviennent très élevés.
[0353] Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des 2 groupes pour leur capacité à séroneutraliser
l’infectivité du SRAS-CoV. 4 points de séroneutralisation sur cellules FRhK-4 (100 TCID50 de SRAS-CoV) sont réalisés
pour chacune des dilutions de raison 2 testées à partir du 1/20. Le titre séroneutralisant est calculé selon la méthode
de Reed et Munsch comme l’inverse de la dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4. Cette analyse montre que
les anticorps induits chez la souris par le polypeptide Ssol sont neutralisants : les titres observés sont très élevés après
2 puis 3 immunisations (supérieurs à 2560 et 5120 respectivement, Tableau XIII).
Tableau XIII : induction d’anticorps dirigés contre le SRAS-CoV après immunisation avec le polypeptide
recombinant Ssol. Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des 2 groupes pour leur capacité à
séroneutraliser l’infectivité de 100 TCID50 du SRAS-CoV sur cellules FRhK-4. 4 points sont réalisés pour chacune
des dilutions de raison 2 testées à partir du 1/20. Le titre séroneutralisant est calculé selon la méthode de Reed et
Munsch comme l’inverse de la dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4.
groupe
Mock
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sérums
Ac. Neutralisants
pi
< 20
IS1
< 20
IS2
< 20
IS3
< 20
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