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EP 1 694 829 B1

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(différence entre DO mesurée sur lysat de cellules infectées et DO mesurée sur lysat de cellules non infectées) après
révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG de souris couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) et du TMB
additionné de H2O2 (KPL) (figure 28A).
[0341] Dans ces conditions, le plasmide d’expression pcDNA-S ne permet l’induction que de faibles titres d’anticorps
dirigées contre la S du SRAS-CoV chez 3 souris sur 6 (LOG10(TI)=1,90,6) alors que le plasmide pcDNA-N permet
l’induction d’anticorps anti-N à des titres élevés (LOG10(TI)= 3,90,3) chez tous les animaux, et les plasmides contrôles
(pCI, pCI-HA) n’entraînent aucun anticorps détectable (LOG10(TI)<1,7). Le plasmide pCI-S muni d’un signal d’épissage
permet l’induction d’anticorps à des titres élevés (LOG10(TI)= 3,70,2), qui sont environ 60 fois supérieurs à ceux
observés après injection du plasmide pcDNA-S (p<10-5).
[0342] L’efficacité des signaux post-transcriptionnels a été étudiée en réalisant une étude dose-réponse des titres en
anticorps anti-S induits chez la souris BALB/c en fonction de la quantité d’ADN plasmidique utilisé comme immunogène
(2Pg, 10 Pg et 50 Pg). Cette étude (figure 28B) démontre que le signal post-transcriptionnel WPRE améliore fortement
l’efficacité de l’immunisation génique lorsque de faibles doses d’ADN sont utilisées (p<10-5 pour une dose de 2 Pg
d’ADN et p<10-2 pour une dose de 10 Pg), alors que l’effet du signal CTE reste marginal (p=0,34 pour une dose de 2
Pg d’ADN).
[0343] Enfin, les anticorps induits chez la souris après immunisation génique neutralisent l’infectivité du SRAS-CoV
in vitro (figures 29A et 29B) à des titres qui sont en rapport avec les titres mesurés par ELISA.
[0344] En résumé, l’utilisation d’un signal d’épissage et du signal post-transcriptionnel WPRE du virus de l’hépatite
de la marmotte améliore de façon considérable l’induction d’anticorps neutralisants dirigés contre le SRAS-CoV après
immunisation génique à l’aide d’ADN plasmidique dirigeant l’expression du cADN de la S du SRAS-CoV.
Exemple 13 : Applications diagnostiques de la protéine S

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[0345] La réactivité en ELISA du polypeptide recombinant Ssol a été analysée vis-à-vis de sérums de patients atteints
de SRAS.
[0346] Les sérums de cas probables de SRAS testés ont été choisis sur la base des résultats (positifs ou négatifs)
d’analyse de leur réactivité spécifique vis-à-vis des antigènes natifs du SRAS-CoV par test d’immunofluorescence sur
cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV et/ou par test ELISA indirect en utilisant comme antigène un lysat de cellules
VeroE6 infectées par le SRAS-CoV. Les sérums de ces patients sont identifiés par un numéro d’ordre du Centre National
de Référence des Virus Influenzae ainsi que par les initiales du patient et le nombre de jours écoulés depuis le début
des symptomes. Tous les sérums de cas probables (cf Tableau XII) reconnaissent les antigènes natifs du SRAS-CoV,
à l’exception du sérum 032552 du patient VTT, pour lequel l’infection par le SRAS-CoV n’a pas pu être confirmée par
RT-PCR réalisée sur prélèvements respiratoires des jours 3, 8 et 12. Un panel de sérums témoin a été utilisé à titre de
contrôle (sérums TV): il s’agit de sérums prélevés en France avant l’épidémie de SRAS survenue en 2003.

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Tableau XII : sérums de cas probables de SRAS

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45

50

55

sérum

patient

jour de prélèvement

031724

JYK

7

033168

JYK

38

033597

JYK

74

032632

NTM

17

032634

THA

15

032541

PHV

10

032542

NIH

17

032552

VTT

8

032633

PTU

16

032791

JLB

3

033258

JLB

27

032703

JCM

8

033153

JCM

29

55