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EP 1 694 829 B1
(suite)
Vecteur
TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE
5

10

15

20

25

30

35

40

45

Clone

DO (450 nm)

WPRE1

0,061

WPRE10

0,134

[0335] La lignée cellulaire sécrétant les quantités les plus élevées de polypeptide Ssol dans le surnageant de culture
est la lignée FRhK4-Ssol-CTE3. Elle a été soumise à une deuxième série de 5 cycles de transduction par le vecteur
TRIP-SD/SA-Ssol-CTE dans des conditions similaires à celles décrites ci-dessus puis clonée. Le sous-clone sécrétant
les quantités les plus élevés de Ssol a été sélectionné par une combinaison d’analyse par western blot et ELISA-capture :
il s’agit du sous-clone FRhK4-Ssol-30, qui a été déposé à la CNCM, le 22 novembre 2004, sous le numéro I-3325.
[0336] La lignée FRhK4-Ssol-30 permet la production et la purification en quantité du polypeptide recombinant Ssol.
Dans une expérience type où les conditions expérimentales de croissance, de production et de purification ont été
optimisées, les cellules de la lignée FRhK4-Ssol-30 sont ensemencées en milieu de culture standard (DMEM sans
pyruvate contenant 4.5g/l de glucose et supplémenté par 5% de SVF, 100 U/ml de pénicilline et 100 Pg/ml de streptomycine) sous la forme d’une monocouche sous-confluente (1 million de cellules pour chaque 100 cm2 dans 20 ml de
milieu). A confluence, le milieu standard est remplacé par le milieu de sécrétion où la quantité de SVF est abaissée à
0.5% et la quantité de milieu réduite à 16 ml pour chaque 100 cm2. Le surnageant de culture est prélevé après 4 à 5
jours d’incubation à 35°C et sous 5% de CO2. Le polypeptide recombinant Ssol est purifié à partir du surnageant par
l’enchaînement d’étapes de filtration sur membrane de polyethersulfone (PES) de 0.1 Pm, de concentration par ultrafiltration sur une membrane de PES de point de coupure 50kD, de chromatographie d’affinité sur matrice anti-FLAG
avec élution par une solution de peptide FLAG (DYKDDDDK) à 100 Pg/ml en TBS (Tris 50mM pH 7.4, 150 mMNaCl)
puis de chromatographie de gel filtration en TBS sur billes de sephadex G-75 (Pharmacia). La concentration du polypeptide recombinant Ssol purifié a été déterminée par test micro-BCA (Pierce) puis ses caractéristiques biochimiques
analysées.
[0337] L’analyse par gel SDS à 8 % d’acrylamide coloré au nitrate d’argent met en évidence un polypeptide majoritaire
dont la masse moléculaire est d’environ 180kD et dont le degré de pureté peut être évalué à 98% (figure 27A). Par
spectrométrie de masse SELDI-TOF (Cyphergen), deux pics principaux sont mis en évidence : ils correspondent à des
formes simplement, et doublement chargées d’un polypeptide majoritaire dont la masse moléculaire est ainsi déterminée
à 182,6  3,7 kD (figures 27B et C). Après transfert sur membrane Prosorb et rincage en TFA 0,1%, l’extrémité Nterminale du polypeptide Ssol a été séquencée en phase liquide par dégradation d’Edman sur 5 résidus (ABI494, Applied
Biosystems) et déterminée comme étant SDLDR (figure 27D). Ceci démontre que le peptide signal localisé à l’extrémité
N-terminale de la protéine S du SRAS-CoV, composé des aa 1 à 13 (MFIFLLFLTLTSG) d’après une analyse réalisée
avec le logiciel signalP v2.0 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering, 10 : 1-6), est clivé du polypeptide Ssol mature.
Le polypeptide recombinant Ssol est donc constitué des acides aminés 14 à 1193 de la protéine S du SRAS-CoV
fusionnés en C-terminal à une séquence SGDYKDDDDK contenant la séquence de l’étiquette FLAG (soulignée). L’écart
entre la masse molaire théorique du polypeptide Ssol nu (132,0 kD) et la masse molaire réelle du polypeptide mature
(182,6 kD) suggère que le polypeptide Ssol est glycosylé.
[0338] Une préparation de polypeptide Ssol purifié et dont la concentration protéique a été déterminée par test microBCA, permet de réaliser une gamme étalon pour mesurer à l’aide du test ELISA-capture décrit plus haut les concentrations
de Ssol présent dans les surnageants de culture et de revisiter les caractéristiques des lignées sécrétrices. Selon ce
test, la lignée FRhK4-Ssol-CT3 sécrète 4 à 6 Pg/ml de polypeptide Ssol tandis que la lignée FRhK4-Ssol-30 sécrète 9
à 13 Pg/ml de Ssol après 4 à 5 jours de culture à confluence. En outre, le schéma de purification présenté plus haut
permet en routine de purifier de 1 à 2 mg de polypeptide Ssol par litre de surnageant de culture.
Exemple 12 : Immunisation génique visant la proteine de spicule (S) du coronavirus associé au SRAS (SRASCoV)

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[0339] L’effet d’un signal d’épissage et des signaux post-transcriptionnels WPRE et CTE a été analysé après immunisation génique de souris BALB/c (figure 28).
[0340] Pour cela, des souris BALB/c ont été immunisées à des intervalles de 4 semaines par injection dans le tibialis
anterior d’une solution saline de 50 Pg d’ADN plasmidique de pcDNA-S et pCI-S ainsi que, à titre de contrôle, par 50
Pg d’ADN plasmidique de pcDNA-N (dirigeant l’expression de la N du SRAS-CoV) ou de pCI-HA (dirigeant l’expression
de la HA du virus grippal A/PR/8/34) et les sérums immuns collectés 3 semaines après la 2ème injection. La présence
d’anticorps dirigés contre la S du SRAS-CoV a été recherchée par ELISA indirect en utilisant comme antigène un lysat
de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV et à titre de contrôle, un lysat de cellules VeroE6 non infectées. Les titres
(TI) en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO spécifique de 0,5

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