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EP 1 694 829 B1
"de base" TRIP-S sont restés infructueux, ce qui démontre la nécessité d’un signal d’épissage ainsi que de l’une, ou
l’autre, des séquences CTE et WPRE pour l’obtention de clones cellulaires stables exprimant la protéine S.
[0331] En outre, ces modifications du vecteur TRIP (insertion d’un signal d’épissage et d’un signal post-transcriptionnel
comme CTE et WPRE) pourraient s’avérer intéressantes pour améliorer l’expression d’autres cDNA que celui de la S.
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3) Obtention de lignées stables permettant l’expression d’une forme soluble de la S du SRAS-CoV. Purification de cet
antigène recombinant

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15

[0332] Un cDNA codant pour une forme soluble de la protéine S (Ssol) a été obtenu en fusionnant les séquences
codant pour l’ectodomaine de la protéine (acides aminés 1 à 1193) à celles d’une étiquette (FLAG : DYKDDDDK) via
un linker BspEl codant pour le dipeptide SG. Pratiquement, pour obtenir le plasmide pcDNA-Ssol, un fragment d’ADN
codant pour l’ectodomaine de la S du SRAS-CoV a été amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 5’-ATAGGATCCA
CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3’ et 5’-ACCTCCGGAT TTAATATATT GCTCATATTT TCCCAA3’ à partir du plasmide pcDNA-S, puis inséré entre les sites uniques BamH1 et BspEl uniques d’un plasmide d’expression
eucaryote pcDNA3.1(+) (Clontech) modifié contenant entre ses sites BamH1 et Xho1 la séquence de l’étiquette FLAG :

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25

30

35

40

45

[0333] Les fragments Nhe1-Xho1 et BamH1-Xho1, contenant le cADN de la S, ont ensuite été excisés du plasmide
pcDNA-Sso1, et sous-clonés entre les sites correspondants du plasmide pTRIP-SD/SA-S-CTE et du plasmide pTRIPSD/SA-S-WPRE, respectivement, pour obtenir les plasmides pTRIP-SD/SA-Ssol-CTE et pTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE,
déposés à la CNCM, le 1er décembre 2004, sous les numéros I-3337 et I-3335, respectivement.
[0334] Des vecteurs pseudotypés ont été produits selon Zennou et coll. (2000, Cell, 101 : 173-185) et utilisés pour
transduire des cellules FRhK-4 (15000 cellules) selon une série de 5 cycles successifs de transduction (15000 cellules)
avec une quantité de vecteur correspondant à 24 ng (TRIP-SD/SA-Ssol-CTE) ou 40 ng TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE) de
p24 par cycle. Les cellules transduites ont été clonées par dilution limite et une série de 16 clones transduits par TRIPSD/SA-Ssol-CTE et de 15 clones par TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE ont été analysés pour l’expression du polypeptide Ssol
par western blot révélé par un anticorps monoclonal anti-FLAG (figure 26 et données non montrées), ainsi que par un
ELISA-capture spécifique du polypeptide Ssol qui a été mis au point dans ce but (Tableau XI et données non montrées).
Une partie du processus de sélection des meilleurs clones sécréteurs est montré dans la figure 26. L’ELISA-capture
repose sur l’utilisation de phases solides recouvertes d’anticorps polyclonaux de lapins immunisés par du SRAS-CoV
purifié et inactivé. Ces phases solides permettent la capture du polypeptide Ssol sécrété dans les surnageants cellulaires,
dont la présence est ensuite révélée par une série d’étapes impliquant successsivement la fixation d’un anticorps
monoclonal anti-FLAG (M2, SIGMA), d’anticorps biotinylés polyclonaux de lapin anti-IgG(H+L) de souris (Jackson) et
d’un conjugué streptavidine-peroxidase (Amersham) puis l’addition de chromogène et de substrat (TMB + H202, KPL).
Tableau XI : analyse de l’expression de polypeptide Ssol par des lignées cellulaires transduites par les
vecteurs lentiviraux TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE et TRIP-SD/SA-Ssol-CTE. La sécrétion du polypeptide Ssol a été
recherchée dans le surnageant d’une série de clones cellulaires isolés après transduction de cellules FRhK-4 par
les vecteurs lentiviraux TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE et TRIP-SD/SA-Ssol-CTE. Les surnageants dilués au 1/50 ont été
analysés par un test ELISA-capture spécifique de la S du SRAS-CoV.
Vecteur
Témoin

50

55

TRIP-SD/SA-Ssol-CTE

Clone

DO (450 nm)

-

0,031

CTE2

0,547

CTE3

0,668

CTE9

0,171

CTE12

0,208

CTE13

0,133

53