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EP 1 694 829 B1
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Tableau X analyse quantitative de l’effet des signaux CTE et WPRE sur l’expression de la S du SRAS-CoV :
Des extraits cellulaires ont été préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6 ou 293T par les plasmides
pCI, pCI-S, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE et analysés par western blot comme décrit dans la légende de la figure 22.
Le western blot est révélé par luminescence (ECL+, Amersham) et acquisition sur un dispositif d’imagerie numérique
(FluorS, BioRad). Les niveaux d’expression sont indiqués en fonction d’une échelle arbitraire où la valeur de 1
représente le niveau mesuré après transfection du plasmide pCI-S. Deux expériences indépendantes ont été réalisées
pour chacun des deux types cellulaires. Dans l’expérience 1 sur cellules VeroE6, les transfections ont été réalisées
en dupliqués et les résultats sont indiqués sous la forme de moyennes et écart-types des niveaux d’expression
mesurés.
Plasmide
Cellule
exp. 1
exp. 2
PCI
VeroE6
0,0
0,0
pCI-S
VeroE6
1,0 0,1
1,0
pCI-S-CTE
VeroE6
9,8 0,9
26,4
pCI-S-WPRE
VeroE6
20,1 2,0
42,3
PCI
293T
0,0
0,0
PCI-S
293T
1,0
1,0
PCI-S-CTE
293T
4,6
4,0
PCI-S-WPRE
293T
27,6
12,8
[0326] En résumé, l’ensemble de ces résultats montre que l’expression dans des cellules de mammifères du cADN
de la S du SRAS-CoV sous la dépendance de séquences promotrices de l’ARN polymérase II, requiert, pour être efficace,
la présence d’un signal d’épissage ainsi que de l’une ou l’autre des séquences WPRE et CTE.
2) Obtention de lignées stables permettant l’expression de la S du SRAS-CoV
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35
40
45
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[0327] Le cADN de la protéine S du SRAS-CoV a été cloné sous la forme d’un fragment BamH1-Xho1 dans le plasmide
pTRIP∆U3-CMV contenant un vecteur lentiviral défectif TRIP à DNA flap central (Sirven et al, 2001, Mol. Ther., 3 :
438-448) pour obtenir le plasmide pTRIP-S (figure 24). La co-transfection transitoire selon Zennou et al (2000, Cell,
101 : 173-185) de ce plasmide, d’un plasmide d’encapsidation (p8.2) et d’un plasmide d’expression de la glycoprotéine
d’enveloppe G du VSV (pHCMV-G) dans des cellules 293T a permis la préparation de pseudoparticules rétrovirales
contenant le vecteur TRIP -S et pseudotypées par la protéine d’enveloppe G. Ces vecteurs TRIP-S pseudotypés ont
été utilisés pour transduire des cellules 293T et FRhK-4 : aucune expression de la protéine S n’a pu être mis en évidence
par western blot et immunofluorescence dans les cellules transduites (données non présentées).
[0328] Les cassettes d’expression optimales constituées du promoteur immédiat/précoce du virus CMV, d’un signal
d’épissage, du cDNA de la S et de l’un ou l’autre des signaux post-transcriptionnels WPRE ou CTE décrites ci-dessus
ont alors été substituées à la cassette EF1α-EGFP du vecteur d’expression lentiviral défectif à DNA FLAP central
TRIP∆U3-EF1α (Sirven et al, 2001, Mol. Ther., 3 :438-448) (figure 25). Ces substitutions ont été réalisées par une série
de sous-clonages successifs des cassettes d’expression de S qui ont été excisées des plasmides pCT-S-CTE (Bg1IIApa1) ou respectivement pCI-S-WPRE (BgIII-Sall) puis insérées entre les sites Mlu1 et Kpn1 ou respectivement Mlu1
et Xho1 du plasmide TRIP∆U3-EF1α pour obtenir les plasmides pTRIP-SD/SA-S-CTE et pTRIP-SD/SA-S-WPRE, déposés à la CNCM, le 1er décembre 2004, sous les numéros I-3336 et I-3334, respectivement. Des vecteurs pseudotypés
ont été produits selon Zennou et al (2000, Cell, 101 : 173-185) et utilisés pour transduire des cellules 293T (10000
cellules) et FRhK-4 (15000 cellules) selon une série de 5 cycles successifs de transduction avec une quantité de vecteur
correspondant à 25 ng (TRIP-SD/SA-S-CTE) ou 22 ng TRIP-SD/SA-S-WPRE) de p24 par cycle.
[0329] Les cellules transduites ont été clonées par dilution limite et une série de clones ont été analysés pour l’expression de la S du SRAS-CoV qualitativement par immunofluorescence (données non montrées), puis quantitativement
par western blot (figure 25) à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S. Les résultats présentés dans la figure 25
montrent que les clones 2 et 15 de cellules FrhK4-s-CTE transduites par TRIP-SD/SA-S-CTE et les clones 4, 9 et 12
de cellules FRhK4-S-WPRE transduites par TRIP-SD/SA-S-WPRE permettent l’expression de la S du SRAS-CoV à
des niveaux respectivement faibles et modérés si on les compare à ceux que l’on peut observer au cours de l’infection
par le SRAS-CoV.
[0330] En résumé, les vecteurs TRIP-SD/SA-S-CTE et TRIP-SD/SA-S-WPRE permettent l’obtention de clones stables
de cellules FRhK-4 et de façon similaire 293T exprimant la S du SRAS-CoV, alors que les essais réalisés avec le vecteur
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