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EP 1 694 829 B1

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oligonucléotides 5’-ATAGGATCCA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3’ et 5’-ATACTCGAGTT ATGTGTAATG TAATTTGACA CCCTTG-3’ à partir du plasmide pSARS-S (C.N.C.M. n° I-3059) puis inséré entre les sites
BamH1 et Xho1 du plasmide pTRIP∆U3-CMV contenant un vecteur lentiviral TRIP (Sirven, 2001, Mol. Ther., 3, 438-448)
pour obtenir le plasmide pTRIP-S. Le fragment BamH1 et Xho1 contenant le cDNA de la S a ensuite été sous-cloné
entre les BamH1 et Xho1 du plasmide d’expression eucaryote pcDNA3.1(+) (Clontech) pour obtenir le plasmide pcDNAS. Le fragment Nhe1 et Xho1 contenant le cADN de la S a ensuite été sous-cloné entre les sites correspondants du
plasmide d’expression pCI (Promega) pour obtenir le plasmide pCI-S. Les séquences WPRE du virus de l’hépatite de
la marmotte ("Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element") et les séquences CTE ("constitutive
transport element") du rétrovirus simien de Mason-Pfizer ont été insérées dans chacun des deux plasmides pcDNA-S
et pCI-S entre les sites Xho1 et Xba1 pour obtenir respectivement les plasmides pcDNA-S-CTE, pcDNA-S-WPRE, pCIS-CTE et pCI-S-WPRE (figure 21). Le plasmide pCI-S-WPRE a été déposé à la CNCM, le 22 novembre 2004, sous le
numéro I-3323. Tous les inserts ont été séquencés à l’aide d’un kit BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) et
d’un séquenceur automatique ABI377.
[0322] La capacité des plasmides construits à diriger l’expression de la S du SRAS-CoV dans des cellules de mammifères a été recherchée après transfection de cellules VeroE6 (figure 22). Dans cette expérience, des monocouches
de 5x105 cellules VeroE6 en boites de Pétri de 35mm ont été transfectées avec 2 Pg des plasmides pcDNA (à titre de
contrôle), pcDNA-S, pCI et pCI-S et 6 Pl de réactif Fugene6 selon les indications du fabricant (Roche). Après 48 heures
d’incubation à 37°C et sous 5% de CO2, des extraits cellulaires ont été préparé en tampon de dépôt selon Laemmli,
séparés sur un gel SDS à 8% de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF (BioRad). La détection
de cette immunoempreinte (« western blot ») a été réalisée à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S (immun-sérum
du lapin P11135 : cf exemple 4 ci-dessus) et d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les IgG de lapin et couplés à
la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés par luminescence à l’aide du kit ECL+ (Amersham) et de films d’autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham).
[0323] Cette expérience (figure 22) montre que le plasmide pcDNA-S ne permet pas de diriger l’expression de la S
du SRAS-CoV à des niveaux détectables tandis que le plasmide pCI-S permet une expression faible, proche de la limite
de détection, qui peut être mise en évidence lorsque le film est surexposé. Des résultats similaires ont été obtenus
lorsque l’expression de la S a été recherchée par immunofluorescence (données non montrées). Cette impossibilité de
détecter une expression efficace de la S ne peut pas être imputée aux techniques de détection utilisées puisque la
protéine S peut être mise en évidence à la taille attendue (180 kDa) dans un extrait de cellules infectées par le SRASCoV ou dans un extrait de cellules VeroE6 infectées par le virus recombinant de la vaccine VV-TF7.3 et transfectées
par le plasmide pcDNA-S. Dans cette dernière expérience, le virus VV-TF7.3 exprime l’ARN polymérase du phage T7
et permet la transcription cytoplasmique d’un ARN non coiffé susceptible d’être traduit efficacement. Cette expérience
suggère que les défauts d’expression décrits ci-dessus sont dus à une incapacité intrinsèque du cADN de la S à être
exprimé efficacement lorsque l’étape de transcription en ARN messager est réalisée au niveau nucléaire.
[0324] Dans une seconde expérience, l’effet des signaux CTE et WPRE sur l’expression de la S a été recherchée
après transfection de cellules VeroE6 (figure 23A) et 293T (figure 23B) et selon un protocole similaire à celui décrit cidessus. Alors que l’expression de la S ne peut pas être mis en évidence après transfection des plasmides pcDNA-SCTE et pcDNA-S-WPRE dérivés de pcDNA-S, l’insertion des signaux WPRE et CTE améliore fortement l’expression
de la S dans le contexte du plasmide d’expression pCI-S.
[0325] Pour préciser ce résultat, une deuxième série d’expériences a été réalisée, où l’immunoempreinte est révélée
de façon quantitative par luminescence et acquisition sur un dispositif d’imagerie numérique (FluorS, BioRad). L’analyse
des résultats obtenus avec le logiciel QuantityOne v4.2.3 (BioRad) montre que les séquences WPRE et CTE augmentent
respectivement l’expression de la S d’un facteur 20 à 42 et 10 à 26 en cellules Vero E6 (Tableau X). En cellules 293T
(Tableau X), l’effet de la séquence CTE est plus modéré (4 à 5 fois) tandis que celui de la séquence WPRE reste
important (13 à 28 fois).

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