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EP 1 694 829 B1
Les solutions (monovalentes ou plurivalentes) sont déposées sous volume de 100 Pl dans les puits et incubées pendant
une nuit à température ambiante. Ces plaques sont ensuite lavées en tampon PBS (10 mM pH 7,4 additionné de 0,1%
de Tween 20) puis saturées avec une solution de PBS additionnée de 0,3% de BSA et de 5% de Saccharose). Les
plaques sont ensuite séchées puis conditionnées dans un sachet en présence d’un dessicant. Elles sont prêtes à l’emploi.
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b) Conjugués
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[0305] Les anticorps purifiés ont été couplés à la péroxydase selon le protocole de Nakane (Nakane et al. - 1974, J.of
Histo and cytochemistry, vol.22, p1084-1091) dans un rapport de une molécule d’IgG pour 3 molécules de péroxydase.
Ces conjugués ont été purifiés par chromatographie d’exclusion et conservés concentrés (concentration comprise entre
1 à 2 mg/ml) en présence de 50% de glycerol et à -20°C. Ils sont dilués pour leur mise en oeuvre dans les essais à la
concentration finale de 1 ou 2 Pg/ml en tampon PBS (pH 7,4) additionné de 1% de BSA.
c) Autres réactifs
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[0306]
20
-
25
-
30
35
40
45
50
55
Sérums humains négatifs pour tous les marqueurs sériques des virus HIV, HBV, HCV et THLV
Pool de sérums humains négatifs additionné de 0,5% de Triton X 100
Ag viral inactivé : surnageant de culture virale inactivé par irradiation et inactivation vérifiée après mise en culture
sur cellules sensibles - titre de la suspension avant inactivation environ 107 particules infectieuses par ml ou encore
environ 5x109 particules virales physiques par ml d’antigène
Les échantillons d’Ag dilués en sérum humain négatif : ces échantillons ont été préparés par dilution au 1:100e puis
par dilution en série de raison 5.
Ces échantillons non infectieux miment des échantillons humains supposés contenir des concentrations faibles à
très faibles de nucléoprotéine virale N. De tels échantillons ne sont pas accessibles pour les travaux de routine
Solution de lavage R2, solution de révélation TMB R8, chromogène R9 et solution d’arrêt R10, sont les réactifs
génériques commercialisés par Bio-Rad dans ses trousses ELISA (ex : trousse Platelia Pylori ref.72778).
2) Mode opératoire
[0307] Les échantillons de sérums humains surchargés en Ag viral inactivé sont distribués à raison de 100 Pl par
cupule, directement dans les plaques sensibilisées, prêtes à l’emploi puis incubés pendant 1 heure à 37°C (incubation
Bio-Rad IPS).
[0308] Le matériel non retenu par la phase solide est éliminé par 3 lavages (lavage avec solution R2 diluée, laveur
automatique LP 35).
[0309] Les conjugués appropriés, dilués à la concentration finale de 1 ou 2 Pg/ml sont distribués à raison de 100 Pl
par cupule et les plaques incubées à nouveau pendant une heure à 37° C (incubation IPS).
[0310] L’excès de conjugué est éliminé par 4 lavages successifs (solution R2 diluée - laveur LP 35).
[0311] La présence de conjugué fixé sur les plaques est révélée après addition de 100 Pl de solution de révélation
préparée avant emploi (1 ml de R9 et 10 ml de R8) et après incubation pendant 30 minutes, à température ambiante et
à l’abri de la lumière.
[0312] La réaction enzymatique est finalement bloquée par addition de 100 Pl de réactif R10 (H2SO4 IN) dans toutes
les cupules.
[0313] La lecture est effectuée à l’aide d’un lecteur de microplaque approprié à double longueur d’onde (450/620 nm).
[0314] Les résultats peuvent être interprétés en utilisant comme valeur seuil provisoire la moyenne d’au moins deux
contrôles négatifs multiplié par un facteur 2 ou encore la moyenne de 100 sérums négatifs additionnée d’un incrément
correspondant à 6 SD (Standart Deviation calculée sur les 100 mesures individuelles).
3) Résultats
[0315] Différentes combinaisons anticorps de capture et anticorps signal ont été testées en se fondant sur les propriétés
des anticorps sélectionnés, et en évitant les combinaisons d’anticorps spécifiques des mêmes épitopes en phase solide
et en conjugués.
[0316] Les meilleurs résultats ont été obtenus avec les 4 combinaisons listées ci-dessous. Ces résultats sont reproduits
dans le tableau IX ci-après.
1. Combinaison F/28
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