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EP 1 694 829 B1
Tableau VII: Comparaison de différentes méthodes d’analyse par amplification génique, à partir de 121
Prélèvements de cas probables de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam (épidémie 2003)
N° CNR
Type
prélèvement
(1)
107
prélèvements
N et P
032529
P
10
032530
N
032531
RT-PCR
nichée
CDC/IP
RT-PCR
nichée
BNI
kit Light
Cycler
Artus
Light
Cycler N
(IP)
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
NHB
Négatif
Positif
Négatif
Négatif
10
NHB
Positif
Positif
3,10E+01
4,20E+01
P
7
LP
Positif
Positif
7,70E+00
3,10E+00
032534
N
15
BND
Positif
Positif
1,60E+00
Négatif
032600
P
4
NHH
Négatif
Positif
Négatif
1,30E+02
032612
P
17
NTS
Négatif
Positif
Négatif
Négatif
032688
P
9
BTX
Positif
Positif
Négatif
Négatif
032689
N
4
NVH
Positif
Positif
1,20E+01
2,30E+02
032690
P
4
NVH
Négatif
Positif
1,60E+00
Négatif
032727
P
8
NVH
Positif
Positif
2,30E+02
4.00E+02
032728
N
8
NVH
Positif
Positif
1,10E+03
1,60E+04
032729
P
14
NHB
Positif
Positif
5,90E+00
3,40E+01
032730
N
14
NHB
Positif
Positif
1,30E+02
4,80E+02
032741
P
8
NHH
Positif
Positif
2,10E+02
1,30E+02
10
14
10
9
71,4%
100,0%
71,4%
64,3%
5
10
15
20
25
Jour
prélèvement
Patient
30
positifs
fraction détectée des 14 positifs
35
(1) P= écouvillonage pharyngé
N= écouvillonage nasal
Exemple 9 : Obtention et caractérisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine N
40
45
50
55
[0295] Des souris Balb C ont été immunisées à l’aide de la protéine N recombinante purifiée et leurs cellules spléniques
fusionnées avec un myélome murin approprié selon les techniques de Köhler et Milstein.
[0296] Dix-neuf hybridomes sécréteurs d’anticorps anti N ont été présélectionnés et leurs immuno réactivités précisées.
Ces anticorps reconnaissent bien la protéine N recombinante (en ELISA) avec des intensités variables, ainsi que la
protéine virale, naturelle N en ELISA et/ou en Western Blot. Les figures 18 à 20 montrent les résultats de ces tests pour
15 de ces 19 anticorps monoclonaux.
[0297] Les clones 12, 17, 28, 57, 72, 76, 86, 87, 98, 103, 146, 156, 166, 170, 199, 212, 218, 219 et 222, fortement
réactifs, ont été sous clonés. Les études de spécificité ont été poursuivies avec les outils appropriés afin de préciser les
épitopes reconnus et vérifier l’absence de réactivité vis-à-vis des autres Coronavirus humains et de certains virus
respiratoires.
[0298] Les études de cartographie (mapping) épitopique (réalisées sur membrane spot, à l’aide de peptides chevauchants de 15 aa) et les études supplémentaires réalisées sur la protéine N naturelle en Western Blot ont révélé l’existence
de 4 groupes d’anticorps monoclonaux :
1° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope linéaire majeur en position N-ter (75-81, séquence : INTNSVP)
Le représentant de ce groupe est l’anticorps 156. L’hybridome produisant cet anticorps a été déposé à la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l’Institut Patseur (Paris, France) le 1er décembre 2004, sous
le numéro I-3331. Ce même épitope est également reconnu par un sérum de lapin (polyclonal anti N) obtenu par
immunisation classique à l’aide de cette même protéine N.
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