EP1694829B1.pdf

EP 1 694 829 B1
(suite)
2.4.
2.5

5

10

72°C
72°C
10°C

30 sec. + 1sec./cycle
5 min.
∞

}

3. Analyser 10 Pl du produit réactionnel sur gel "low-melting" (type Seakem GTG) à 3% d’agarose.
La sensibilité du test niché est en routine, dans les conditions décrites, de 10 copies d’ARN.
4. Les fragments peuvent ensuite être purifiés sur QIAquick PCR kilt (QIAGEN) et séquencés avec les oligos SAR1-S
et SAR1-AS.
3) Détection de l’ARN du SARS-CoV par PCR à partir de prélèvements respiratoires
a) Première étude comparative

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0288] Une étude comparative a été réalisée sur une série de prélèvements respiratoires reçus par le Centre National
de Référence du Virus Influenzae (région nord) et susceptibles de contenir du SARS-CoV. Pour ce faire, l’ARN a été
extrait des prélèvements à l’aide du kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen) et analysé par RT-PCR en temps réel,
d’une part à l’aide des couples d’amorces et de sondes de la série n° 2 dans les conditions décrites ci-dessus d’une
part, et d’autre part à l’aide du kit "LightCycler SARS-CoV quantification kit" commercialisé par Roche (référence 03 604
438). Les résultats sont résumés dans le Tableau VI ci-dessous. Ils montrent que 18 des 26 prélèvements sont négatifs
et 5 des 26 prélèvements sont positifs pour les deux kits, tandis qu’un prélèvement est positif pour le seul kit Roche et
deux pour les seuls réactifs N "série2". En outre, pour 3 prélèvements (20032701, 20032712, 20032714) les quantités
d’ARN détectés sont nettement supérieures avec les réactifs (sondes et amorces) de la série n°2. Ces résultats indiquent
que les amorces et sondes N "série2" sont plus sensibles pour la détection du génome du SARS-CoV dans des prélèvements biologiques que celles du kit actuellement disponible.
Tableau VI: Analyse par RT-PCR en temps réel des ARN extraits d’une série de prélèvements de 5 patients
à l’aide des couples d’amorces et de sondes de la série n° 2 (N "série 2") ou du kit "LightCycler SARS-CoV
quantification kit" (Roche). Le type de prélèvement est indiqué ainsi que le nombre de copies de génome
viral mesurées dans chacun des deux tests. NEG : RT-PCR négative.
Prélèvements n°

Patient

Type de
prélèvement

KIT ROCHE

N "série2"

20033082
20033083
20033086
20033087
20032802
20032803
20032806
20031746ARN2
20032711
20032910
20032911
20033356
20033357
20031725
20032657
20032698
20032720
20033074
20032701
20032702
20031747ARN2

K
K
K
K
M
M
M
C
C
B
B
V
V
K
K
K
K
K
M
M
C

nasal
pharyngé
nasal
pharyngé
nasal
expectoration
nasal ou pharyngé
pharyngé
nasal ou pharyngé
nasal
pharyngé
expectoration
expectoration
asp. endotrachéale
asp. endotrachéale
asp. endotrachéale
asp. endotrachéale
selles
pharyngé
expectoration
pharyngé

NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
39
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
3
115
443
NEG
NEG

NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
150
NEG
NEG
5
257
1676
249
NEG

45