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EP 1 694 829 B1
(suite)

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Prélèvements n°

Patient

Type de
prélèvement

KIT ROCHE

N "série2"

20032712
20032714
20032800
20033353
20033384

C
C
B
V
V

inconnu
pharyngé
nasal
nasal
nasal

634
17
NEG
NEG
NEG

6914
223
NEG
NEG
NEG

10

b) Deuxième étude comparative

15

20

[0289] Les performances de différentes méthodes de RT-PCR nichée et de RT-PCR en temps réel ont ensuite été
comparées pour 121 prélèvements respiratoires de cas possibles de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam,
réalisés entre le 4ème et le 17ème jour après le début des symptômes. Parmi ces prélèvements, 14 avaient été trouvés
positifs lors d’un premier test utilisant la méthode de RT-PCR nichée ciblant l’ORFlb (codant pour la réplicase) telle que
décrite initialement par le Bernhard Nocht Institute (RT-PCR nichée BNI). Des informations concernant ce test sont
disponibles sur internet, à l’adresse http://wwwl5.bni-hamburg.de/bnilbn12/neu2/getfile.acgi?area_engl=diagnostics&pid=4112.
[0290] Les différents tests comparés dans cette étude sont :
-

25

-

30

35

40

45

50

la méthode de RT-PCR quantitative selon l’invention, avec les amorces et sonde N "série 2" décrite ci-dessus
(colonne Light Cycler N),
le test de RT-PCR nichée ciblant le gène de l’ARN polymérase décrit ci-dessus, développé par le CDC, le BNI et
l’Institut Pasteur (RT-PCR nichée CDC/IP),
le kit ARTUS de référence "HPA Corona LC RT-PCR Kit # 5601-02", qui est un test de RT-PCR en temps réel
ciblant le gène ORF1b,
le test de RT-PCR nichée du BNI, ciblant également le gène de l’ARN polymérase, mentionné ci-dessus.

[0291]

Les inventeurs ont constaté :

1) une variabilité inter-test pour une même technique, liée à la dégradation de la préparation d’ARN lors de décongélations répétées, notamment pour les échantillons contenant les quantités d’ARN les plus faibles,
2) une sensibilité réduite de la RT-PCR nichée CDC/IP par rapport à la RT-PCR nichée BNI, et
3) une sensibilité comparable du test de RT-PCR quantitative selon l’invention (Light Cycler N) par rapport au test
Light Cycler (LC) Artus.
[0292] Ces résultats, présentés dans le Tableau VII ci-dessous, montrent que le test par RT-PCR quantitative selon
l’invention constitue un excellent complément - ou une alternative - aux tests actuellement disponibles. En effet, le
coronavirus lié au SRAS est un virus émergent, susceptible d’évoluer rapidement. En particulier, le gène de la RNA
polymérase du coronavirus lié au SRAS, qui est ciblé dans la plupart des tests actuellement disponibles, peut recombiner
avec celui d’autres coronavirus non liés au SRAS. L’utilisation d’un test ciblant exclusivement ce gène pourrait alors
conduire à l’obtention de faux négatifs.
[0293] Le test par RT-PCR quantitative selon l’invention ne cible pas la même région génomique que le kit ARTUS,
puisqu’il cible le gène codant pour la protéine N. En réalisant un test de diagnostique ciblant deux gènes différents du
coronavirus lié au SRAS, on peut donc espérer s’affranchir de résultats de type faux négatifs, qui pourraient être dus à
l’évolution génétique du virus.
[0294] De plus, il apparaît particulièrement avantageux de cibler le gène de la protéine de nucléocapside, car il est
très stable, du fait de la forte pression de sélection liée aux contraintes structurales élevées concernant cette protéine.

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