EP1694829B1.pdf

EP 1 694 829 B1
(suite)
Oligo SNE-AS1 50 PM
RNAsin 40 U/Pl
RT/Platinum Taq mix

5

0,2 Pl
0,12 Pl
0, 5 Pl

2. A 20 Pl du mix, ajouter 5 Pl d’ARN et procéder à l’amplification sur thermocycleur (conditions ABI 9600) :
2.1
10

2.2.
15

2.3.

2.4.
2.5

20

25

45°C
55°C
94°C
94°C
45°C
72°C
94°C
55°C
72°C
72°C
10°C

30 min.
15 min.
2 min.
15 sec.
30 sec.
30 sec.
15 sec.
30 sec.
30 sec. + 2sec./cycle
5 min.
∞

}
} x 5 cycles
}
}
} x 35 cycles
}

Conservation à +4°C.
[0285] La RNAsin (N2511/N2515) de Promega a été utilisée comme inhibiteurs de RNase.
[0286] Des ARN synthétiques ont servi de témoin positif. A titre de contrôle, 103, 102 et 10 copies d’ARN synthétique
RSNE ont été amplifiées dans chaque expérience.

Seconde étape : PCR nichée "SAR"
30

Oligonucléotides :
[0287]

35

-

SAR1-S 5’ CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA 3’
SAR1-AS 5’ TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG 3’

-> Taille attendue : 121 pb
1. Préparer un mix :
H2O
Tampon Taq 10X
MgCl2 25 mM
Mix dNTPs 5 mM
Oligo SAR1-S 50 PM
Oligo SAR1-AS 50 PM
Taq ADN pol 5 U/Pl

40

45

50

35,8 Pl
5 Pl
4 Pl
2 Pl
0,5 Pl
0,5 Pl
0,25 Pl

L’AmpliTaq DNA Pol d’Applied Biosystems a été utilisée (tampon 10X sans MgCl2, réf 27216601).
2. A 48 Pl du mix, ajouter 2 Pl du produit de la première PCR et procéder à l’amplification (conditions ABI 9600) :
2.1.
2.2.

55

2.3.

94°C
94°C
45°C
72°C
94°C
55°C

2 min.
30 sec.
45 sec.
30 sec.
30 sec.
30 sec.

}
} x 5 cycles
}
}
} x 35 cycles

44