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EP 1 694 829 B1
c) mise au point de la RT-PCR en temps réel

5

10

[0279] Une RT-PCR en temps réel a été mise au point à l’aide du couple d’amorces n°2 et du couple de sonde constitué
par SRAS/N/FL et SRAS/N/LC705 (figure 2).
[0280] L’amplification a été réalisée sur un LightCycler™ (Roche) à l’aide du kit "Light Cycler RNA Amplification Kit
Hybridization Probes " (référence 2 015 145, Roche) dans les conditions optimisées suivantes. Un Mélange réactionnel
contenant : H2O (6,8 Pl), MgCl2 25 mM (0,8 Pl, 4 PM final de Mg2+), mélange réactionnel 5X (4 Pl), sonde SRAS/N/FL
3 PM (0,5 Pl, 0,075 PM final), sonde SRAS/N/LC705 3 PM (0,5 Pl, 0,075 PM final), amorce N/+/28375 10 PM (1 Pl, 0,5
PM final), amorce N/-/28702 10 PM (1 Pl, 0,5 PM final), mélange d’enzyme (0,4 Pl) et échantillon (ARN viral, 5 Pl) a été
amplifié en suivant le programme suivant :
-

15

-

20

25

30

Transcription inverse : 50°C 10:00min analysis mode: none
Dénaturation : 95°C 30sec x1 analysis mode: none
Amplification : 95°C 2sec }
50°C . 15sec analysis mode: quantification*} x45
72°C 13sec rampe thermique 2,0°C/sec }
refroidissement : 40°C 30sec x1 analysis mode: none

*La mesure de fluorescence se fait à la fin de l’hybridation et à chaque cycle (en mode SINGLE).
[0281] Les résultats présentés à la figure 12 montrent que cette RT-PCR en temps réel est très sensible puisqu’elle
permet de détecter 102 copies d’ARN synthétique dans 100% des 5 échantillons analysés (29/29 échantillons dans 8
expériences) et jusqu’à 10 copies d’ARN dans 100% des 5 échantillons analysés (40/45 échantillons dans 8 expériences).
Elle montre également que cette RT-PCR permet de détecter la présence du génome du SARS-CoV dans un échantillon
et de quantifier le nombre de génomes présents. A titre d’exemple, l’ARN viral d’un stock de SARS-CoV cultivé sur
cellules Vero E6 a été extrait à l’aide du kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen), dilué à 0,05.10-4 et analysé par RTPCR en temps réel selon le protocole décrit ci-dessus; l’analyse présentée à la figure 12 montre que ce stock de virus
contient 6,5.109 génomes -équivalents/ml (geq/ml), ce qui est tout à fait similaire à la valeur de 1,0.1010 geq/ml mesurée
à l’aide du kit "RealArt™ HPA-Coronavirus LC RT PCR Reagents" commercialisé par Artus.
2) Mise au point de conditions de RT-PCR nichée ciblant le gène de l’ARN polymérase - test "RT-PCR nichée
CDC (Centers for Disease Control and Prevention) /IP"
a) Extraction de l’ARN viral

35

[0282] Echantillon clinique : QIAamp viral RNA Mini Kit (QIAGEN) selon les indications du fabricant, ou une technique
équivalente. L’ARN est élué dans un volume de 60 Pl.
b) RT-PCR nichée "SNE/SAR"

40

Première étape : RT-PCR couplée « SNE »
[0283] Le kit Invitrogen "Superscript™ One-Step RT-PCR with Platinum® Taq"a été utilisé, mais le kit "Titan" de
Roche Boehringer peut lui être substitué avec des résultats similaires.

45

Oligonucléotides :
[0284]

50

-

SNE-S1 5’ GGT TGG GAT TAT CCA AAA TGT GA 3’
SNE-AS1 5’GCA TCA TCA GAA AGA ATC ATC ATG 3’

-> Taille attendue :440 pb
1. Préparer un mix :
55

H2O
Reaction mix 2X
Oligo SNE-S1 50 PM

43

6,5 Pl
12,5 Pl
0,2 Pl