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EP 1 694 829 B1
Exemple 8 : Détection du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) par RT-PCR
1) Mise au point de conditions de RT-PCR en temps réel à l’aide d’amorces spécifiques du gène de la protéine
de nucléocapside - test "Light Cycler N"
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a) conception des amorces et des sondes

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[0272] La conception des amorces et sondes a été réalisée à partir de la séquence du génome de la souche de SARSCoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589, à l’aide du programme "Light Cycler Probe Design (Roche)".
Ainsi les deux séries d’amorces et de sondes suivantes ont été sélectionnées :
- série 1 (SEQ ID NO : 60, 61, 64, 65):
[0273]

15

-

amorce sens : N/+/28507 : 5’-GGC ATC GTA TGG GTT G-3’ [28507-28522]
amorce antisens : N/-/28774 : 5’-CAG TTT CAC CAC CTC C-3’ [28774-28759]
sonde 1 : 5’-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-fluorescéine 3’ [28561-28586]
sonde 2 : 5’ Red705 -GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-phosphate [28588-28608]

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- série 2 (SEQ ID NO : 62, 63, 66, 67)
[0274]
25

-

30

b) analyse de l’efficacité des deux couples amorces

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[0275] Afin de tester l’efficacité respective des deux couples d’amorces, une amplification par RT-PCR a été réalisée
sur un ARN synthétique correspondant aux nucléotides 28054-29430 du génome de la souche de SARS-CoV issue du
prélèvement répertorié sous le numéro 031589et contenant la séquence du gène N.
[0276] De manière plus précise :

40

45

50

55

amorce sens : N/+/28375 : 5’-GGC TAC TAC CGA AGA G-3’ [28375-28390]
amorce antisens : N/-/28702 : 5’-AAT TAC CGC GAC TAC G-3’ [28702-28687]
sonde 1 : SRAS/N/FL : 5’-ATA CAC CCA AAG ACC ACA TTG GC - fluorescéine 3’ [28541-28563]
sonde 2 : SRAS/N/LC705 : 5’ Red705 -CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C-phosphate 3’ [28565-28589]

Cet ARN synthétique a été préparé par transcription in vitro à l’aide de l’ARN polymérase du phage T7, d’une matrice
d’ADN obtenu par linéarisation du plasmide SRAS-N avec l’enzyme Bam H1. Après élimination de la matrice d’ADN
par digestion à l’aide de DNAse 1, les ARN synthétiques sont purifiés par une extraction au phénol-chloroforme
suivie de deux précipitations successives en acétate d’ammonium et isopropanol. Ils sont alors quantifiés par mesure
de l’absorbance à 260 nm et leur qualité est contrôlée par le rapport des absorbances à 260 et 280 nm ainsi que
par une électrophorèse en gel d’agarose. Ainsi, la concentration de la préparation d’ARN synthétique utilisée pour
ces études est de 1,6 mg/ml, ce qui correspond à 2,1.1015 copies/ml d’ARN.
[0277] Des quantités décroissantes d’ARN synthétique ont été amplifiés par RT-PCR à l’aide du kit "Superscript™
One-Step RT-PCR with Platinum® Taq" et les couples d’amorces n° 1 (N/+/28507, N/-/28774) (figure 1A) et n° 2 (N/+/
28375, N//28702) (figure 1B), en suivant les indications du fournisseur. Les conditions d’amplification utilisées sont les
suivantes : l’ADNc a été synthétisé par incubation 30 min à 45 °C, 15 min à 55°C puis 2 min à 94 °C puis il a été amplifié
par 5 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 45°C pendant
30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 30 sec, suivis de 35 cycles comprenant : une étape de dénaturation
à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 55°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 30
sec, avec 2 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, et d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min.
Les produits d’amplification obtenus ont ensuite été maintenus à 10°C.
[0278] Les résultats présentés à la figure 11 montrent que le couple d’amorces n° 2 (N/+/28375, N/-/28702) permet
de détecter jusqu’à 10 copies d’ARN (bande de faible intensité) ou 102 copies (bande de bonne intensité) contre 104
copies pour le couple d’amorces n° 1 (N/+/28507, N/-/28774). Les amplicons sont respectivement de 268 pb (couple 1)
et de 328 pb (couple 2).

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