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EP 1 694 829 B1
et THUMBUP (Zhou et Zhou, 2003, Protein Science 12 :1547-1555) confirment une localisation externe de l’extrémité
N-terminale de E.
b) Protéine M
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[0240] Une analyse similaire réalisée sur la protéine M du SARS-CoV (221 acides aminés) montre que ce polypeptide
ne possède pas de peptide signal (d’après le logiciel signalP v1.1) mais trois domaines transmembranaires (résidus
15-37, 50-72, 77-99 d’après THMM2.0) et un grand domaine hydrophile (aa 100-221) localisé à l’intérieur de la particule
virale (endodomaine). Elle est vraisemblablement glycosylée sur l’asparagine en position 4 (d’après NetNGlyc 1.0).
[0241] Ainsi, en accord avec les données expérimentales connues pour les autres coronavirus, il est remarquable
que les deux protéines M et E présentent des endodomaines correspondant à la majeure partie des polypeptides et des
ectodomaines de très petite taille.
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l’ectodomaine de E correspond vraisemblablement aux résidus 1 à 11 ou 1 à 12 de la protéine : MYSFVSEETGT
(L), SEQ ID NO : 70. En effet, la probabilité associée à la localisation transmembranaire du résidu 12 est intermédiaire
(0,56 d’après THMM 2.0).
l’ectodomaine de M correspond vraisemblablement aux résidus 2 à 14 de la protéine : ADNGTITVEELKQ, SEQ ID
NO : 69. En effet, la méthionine N-terminale de M est très probablement clivée du polypeptide mature car le résidu
en position 2 est une Alanine (Varshavsky, 1996, 93:12142-12149).
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[0242] Par ailleurs, l’analyse de l’hydrophobicité (Kyte & Doolittle, Hopp & Woods) de la protéine E met en évidence
que l’extrémité C-terminale de l’endodomaine de E est hydrophile et donc vraisemblablement exposée à la surface de
ce domaine. Ainsi, un peptide synthétique correspondant à cette extrémité est un bon candidat immunogène pour induire
chez l’animal des anticorps dirigés contre l’endodomaine de E. En conséquence, un peptide correspondant aux 24
résidus C-terminaux de E a été synthétisé.
2) Préparation d’anticorps dirigés contre l’ectodomaine des protéines M et E et l’endodomaine de la protéine E
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[0243] Les peptides M2-14 (ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO : 69), E1-12 (MYSFVSEETGTL, SEQ ID NO: 70) et
E53-76 (KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV, SEQ ID NO : 71) ont été synthétisés par Neosystem. Ils ont été couplés
à la KLH (Keyhole Limpet Heinocyanin) à l’aide du MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) via une
cystéine ajoutée au cours de la synthèse soit en N-terminal du peptide (cas de E53-76) soit en C-terminal (cas de M2-14
et E1-12).
[0244] Deux lapins ont été immunisés avec chacun des conjugués, en suivant le protocole d’immunisation suivant :
après une première injection de 0,5 mg de peptide couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant complet de Freund (voie
intradermique), les animaux reçoivent 2 à 4 injections de rappel à 3 ou 4 semaines d’intervalle de 0,25 mg de peptide
couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant incomplet de Freund.
[0245] Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la première immunisation et un immunsérum (I.S.) est préparé 3 à 5 semaines après les injections de rappel.
[0246] La réactivité des sérums a été analysée par western blot à l’aide d’extraits de cellules infectées par le SRASCoV (figure 43B) ou à l’aide d’extraits de cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine exprimant la protéine
E (VV-TG-E, figure 43A) ou M (VV-TN-M, figure 43C) de l’isolat 031589 du SRAS-CoV.
[0247] Les immunsérums des lapins 22234 et 22240, immunisés par le conjugué KLH-E53-76, reconnaissent un
polypeptide d’environ 9 à 10kD, qui est présent dans les extraits de cellules infectées par le SRAS-CoV mais absent
dans les extraits de cellules non infectées (figure 43B). La masse apparente de ce polypeptide est compatible avec la
masse prédite de la protéine E, qui est de 8,4 kD. De façon similaire, l’immunsérum du lapin 20047, immunisé par le
conjugué KLH-E1-12, reconnaît un polypeptide présent dans les extraits de cellules infectées par le virus VV-TG-E,
dont la masse molaire apparente est compatible avec celle de la protéine E (figure 43A).
[0248] L’immunsérum des lapin 20013 et 20080, immunisés par le conjugué KLH-M2-14, reconnaît un polypeptide
présent dans les extraits de cellules infectées par le virus VV-TN-M (figure 43C), dont la masse molaire apparente (18
kD environ) est compatible avec celle de la glycoprotéine M, qui est de 25,1 kD et présente un point isoélectrique élevé
(9.1 pour le polypeptide nu).
[0249] Ces résultats démontrent que les peptides El-12 et E53-76 d’une part et le peptide M2-14 d’autre part permettent
d’induire chez l’animal des anticorps polyclonaux capables de reconnaître les formes natives des protéines E et M
respectivement du SRAS-CoV.
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