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EP 1 694 829 B1
pendant une nuit. La saturation se fait par un prélavage en tampon PBS 10mM / tween 0,1%, suivi d’un lavage avec
une solution de saturation PBS, 25% lait /saccharose.

Diluant serums
5

[0255]

Tampon TRIS 0,48g/L, PBS 10mM, EDTA 3,7g/L,lait 15% v/v , pH 6,7

Diluant conjugué
10

[0256]

Tampon citrate (15g/L), tween 0,5% , sérum bovin 25%, NaCl 12%, lait écrémé 6% v/v PH 6,5

Conjugué
[0257]

Conjugué anti-IgG humaines 50X, commercialisés par Bio-Rad : kit Platelia H. pylori ref 72778

15

Autres solutions :
[0258] Solution de lavage R2, Solutions de révélation au TMB R8 diluant, R9 chromogène, R10 solution d’arrêt :
réactifs commercialisés commercialisées par Bio-Rad (ex : kit Platelia pylori, ref 72778)
20

b) Mode opératoire
[0259]
25

30

35

40

Diluer les serums au 1/200 dans le diluant échantillons
Distribuer 100PL/puits
Incubation 1h à 37°C
3 lavages en solution de LAVAGE R2 10x préalablement diluée 10 fois en eau déminéralisée (i.e., solution de lavage
1X)
Distribuer 100PL de conjugué (conjugué 50x à diluer extemporanément dans le diluant conjugué fourni)
Incubation 1h à 37°C
4 lavages en solution de lavage 1X
distribuer 200PL/puits de solution de révélation (à diluer extemporanément ex: mL de R9 dans 10mL de R8)
Incubation 30 min à température ambiante à l’obscurité
arrêter la réaction avec 100PL/puits de R10
LECTURE à 450/620nm
[0260] Les résultats peuvent être interprétés en prenant un sérum SEUIL donnant une réponse au delà de laquelle
les serums testés seront considérés comme positifs. Ce sérum est choisi et dilué de façon à donner un signal significativement supérieur au bruit de fond.
2) Test ELISA DOUBLE EPITOPE
a Réactifs

45

Préparation des plaques

50

[0261] Les plaques sont sensibilisées par une solution de protéine N à 1Pg/mL dans un tampon PBS 10mM pH 7,2,
rouge de phénol à 0,25mL /L. 100 PL de solution sont déposés dans les puits et laissés incubés à température ambiante
pendant une nuit. La saturation se fait par un prélavage en tampon PBS 10mM / O,1% tween suivi d’un lavage avec
une solution de saturation PBS 10mM, lait 25% (V/V)

Diluant serums et conjugué
55

[0262]

Tampon TRIS saline 50mMpH8, lait 2%

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