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EP 1 694 829 B1
Exemple 6 : Analyse de la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante, vis-à-vis de sérums de patients
atteints de SRAS
1) Matériel
5
[0250] L’antigène utilisé pour préparer les phases solides est la nucléoprotéine N recombinante purifiée préparée
selon le protocole décrit à l’exemple 2.
[0251] Les sérums à tester (Tableau IV) ont été choisis sur la base des résultats d’analyse de leur réactivité par
immunofluorescence (titre IF-SRAS), vis-à-vis de cellules infectées par le SARS-CoV.
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Tableau IV: Sérums testés en ELISA
15
20
Référence
N° sérum
Type de sérum
Date du Sérum***
Titre IF-SRAS
3050
A
Témoin
na*
nt**
3048
B
Témoin
na
nt
033168
D
Patient 1- SRAS
27/04/03 (J38)
320
033397
E
Patient-1 SRAS
11/05/03 (J52)
320
032632
F
Patient-2 SRAS
21/03103 (J17)
2500
032791
G
Patient-3 SRAS
04/04/03 (J3)
<40
033258
H
Patient-3 SRAS
28/04/03 (J27)
160
*na : non-applicable. ** nt : non-testé. *** les dates indiquées correspondent au nombre
de jours après le début des symptômes de SRAS.
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2) Méthode
30
35
40
45
[0252] La protéine N (100 Pl) diluée à différentes concentrations dans du tampon carbonate 0,1 M, pH 9,6 (1, 2 ou 4
Pg/ml) est distribuée dans les puits de plaques ELISA, puis les plaques sont incubées une nuit à température du
laboratoire. Les plaques sont lavées avec du tampon PBS-Tween, saturées avec du tampon PBS-lait écrémé-saccharose
(5 %). Les sérums à tester (100 Pl) préalablement dilués (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 et 1/3200) sont
ajoutés, puis les plaques sont incubées 1 h à 37° C. Après 3 lavages, le conjugué anti-IgG humaines marqué à la
peroxydase (référence 209-035-098, JACKSON) dilué au 1/18000 est ajouté puis les plaques sont incubées 1h à 37
°C. Après 4 lavages, le chromogène (TMB) et le substrat (H202) sont ajoutés et les plaques sont incubées 30min à
température ambiante, à l’abri de la lumière. La réaction est ensuite arrêtée puis l’absorbance à 450 nm est mesurée
à l’aide d’un lecteur automatique.
3) Résultats
[0253] Les tests ELISA (figure 10) démontrent que la préparation de protéine N recombinante est reconnue spécifiquement par les anticorps de sérums de patients atteints de SRAS prélevés en phase tardive de l’infection (≥ 17 jours
après le début des symptômes) alors qu’elle n’est pas reconnue de façon significative par les anticorps d’un sérum de
patient prélevé en phase précoce de l’infection (3 jours après le début des symptômes) ni par des sérums témoins de
sujets non atteints de SRAS.
Exemple 7 : Tests ELISA élaborés pour une détection très spécifique et sensible d’une infection par le coronavirus associé au SRAS, à partir de sérums de patients
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1) Test ELISA IgG indirect
a Réactifs
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Préparation des plaques
[0254] Les plaques sont sensibilisées par une solution de protéine N à 2Pg/mL dans un tampon PBS 10mM pH 7,2,
rouge de phénol à 0,25mL /L. 100 PL de solution sont déposés dans les puits et laissés incubés à température ambiante
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