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EP 1 694 829 B1
Exemple 4 : Réparation d’anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines N et S du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV)
1) Matériel et méthode
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[0230] Trois lapins (P13097, P13081, P13031) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant purifié correspondant à l’intégralité de la nucléoprotéine (N), préparé selon le protocole décrit à l’exemple 2. Après une première injection
de 0,35 mg par lapin de protéine émulsionnée en adjuvant complet de Freund (voie intradermique), les animaux ont
reçus 3 injections de rappel à 3 puis 4 semaines d’intervalle, de 0,35 mg de protéine recombinante émulsionnée en
adjuvant incomplet de Freund.
[0231] Trois lapins (P11135, P13042, P14001) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant correspondant au
fragment court de la protéine S (SC), produit comme décrit à l’exemple 2. Comme ce polypeptide est retrouvé principalement sous la forme de corps d’inclusion dans le cytoplasme bactérien, les animaux ont reçus 4 injections intra-dermiques
à 3-4 semaines d’intervalle d’une préparation de corps d’inclusion correspondant à 0,5 mg de protéine recombinante
émulsionnée en adjuvant incomplet de Freund. Les 3 premières injections ont été réalisées avec une préparation de
corps d’inclusion préparés selon le protocole décrit à l’exemple 2, tandis que la quatrième injection a été réalisée avec
une préparation de corps d’inclusion qui ont été préparés selon le protocole décrit à l’exemple 2 puis purifiés sur gradient
de saccharose et lavés en 2 % Triton X100.
[0232] Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la première immunisation et un immunsérum (I.S.) 5 semaines après la quatrième immunisation.
[0233] Dans un premier temps, la réactivité des sérums a été analysée par test ELISA vis à vis de préparations de
protéines recombinantes semblables à celles utilisées pour les immunisations ; les tests ELISA ont été réalisés selon
le protocole et avec les réactifs tels que décrits à l’exemple 6.
[0234] Dans un deuxième temps, la réactivité des sérums a été analysée en réalisant une immunoempreinte (western
blot) d’un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV, en suivant le protocole tel que décrit à l’exemple 3.
2) Résultats

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[0235] Les tests ELISA (figure 9) démontrent que les préparations de protéine N recombinante et de corps d’inclusion
du fragment court de la protéine S (SC) sont immunogènes chez l’animal et que le titre des sérums immuns est élevé
(plus de 1/25000).
[0236] L’immunoempreinte (figure 8) montre que le sérum immun du lapin P13097 reconnaît deux polypeptides présents dans les lysats de cellules infectées par le SARS-CoV : un polypeptide dont la masse moléculaire apparente
(50-55 kDa selon les expériences) est compatible avec celle de la nucléoprotéine N (422 résidus, masse moléculaire
prédite de 46 kDa) et un polypeptide de 35 kDa, qui représente vraisemblablement une forme tronquée ou dégradée
de la N.
[0237] Cette expérience montre également que le sérum du lapin P11135 reconnaît principalement un polypeptide
dont la masse moléculaire apparente (180-220 kDa selon les expériences) est compatible avec une forme glycosylée
de la S (1255 résidus, chaîne polypeptidique non glycosylée de 139 kDa), ainsi que des polypeptides plus légers, qui
représentent vraisemblablement des formes tronquées et/ou non glycosylées de la S.
[0238] En conclusion, l’ensemble de ces expériences démontrent que des polypeptides recombinants exprimés chez
E. coli et correspondant aux protéines N et S du SARS-CoV permettent d’induire chez l’animal des anticorps polyclonaux
capables de reconnaître les formes natives de ces protéines.
Exemple 5 : Préparation d’anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines M et E du
coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV)
1) Analyse de la structure des protéines M et E

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a) Protéine E

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[0239] La structure de la protéine E du SARS-CoV (76 acides aminés) a été analysée in silico , à l’aide de différents
logiciels comme signalP v1.1, NetNGlyc 1.0, THMM 1.0 et 2.0 (Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol., 305(3):567-580) ou
encore TOPPRED (von Heijne, 1992, J. Mol. Biol. 225, 487-494). L’analyse montre que ce polypeptide non glycosylé
est une protéine membranaire de type 1, contenant une seule hélice transmembranaire (aa 12-34 d’après THMM), et
dont la plus grande partie du domaine hydrophile (42 résidus) est localisée à l’extrémité C-terminale et vraisemblablement
à l’intérieur de la particule virale (endodomaine). On peut noter une inversion dans la topologie prédite par les versions
1.0 (N-ter est externe) et 2.0 (N-ter est interne) du logiciel THMM, mais que d’autres algorithmes, notamment TOPPRED

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