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EP 1 694 829 B1
1) Matériel
a) lysat de cellules infectées par le SARS-CoV
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[0222] Des cellules Vero E6 (2x106) ont été infectées par le SARS-CoV (isolat répertorié sous le numéro FFM/MA104)
à une multiplicité d’infection (M.O.I.) de 10-1 ou 10-2 puis incubées dans du milieu DMEM contenant 2% de SVF, à 35°C
dans une atmosphère contenant 5% de CO2. 48 heures plus tard, le tapis cellulaire a été lavé avec du PBS puis lysé
avec 500 Pl de tampon de dépôt préparé selon Laemmli et contenant du β-mercaptoéthanol. Les échantillons ont ensuite
été bouillis 10 minutes puis soniqués 3 fois 20 secondes.

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b) anticorps
b1) sérum de patient atteint de pneumopathie atypique
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[0223] Le sérum référencé au Centre National de Référence des virus influenzae (Région-Nord) sous le N° 20033168
est celui d’un patient français atteint d’une pneumopathie atypique causée par le SARS-CoV prélevé au jour 38 après
le début des symptômes ; le diagnostic d’infection par le SARS-CoV a été réalisé par RT-PCR nichée et PCR quantitative.
b2) sérums polyclonaux de lapin monospécifiques dirigés contre la protéine N ou la protéine S
[0224] Les sérums sont ceux produits à partir des protéines recombinantes N et SC (exemple 2), selon le protocole
d’immunisation décrit à l’exemple 4 ; il s’agit du sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) et du sérum du lapin P11135
(sérum anti-S).

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2) Méthode
[0225] 20 Pl de lysat de cellules infectées par le SARS-CoV à des M.O.I. de 10-1 et 10-2 et, à titre de contrôle, 20 Pl
d’un lysat de cellules non infectées (mock) ont été séparés sur un gel SDS à 10% de polyacrylamide puis transférés
sur une membrane de nitrocellulose. Après blocage dans une solution de PBS/lait 5%/Tween 0,1% et lavage en PBS/
Tween 0,1%, cette membrane a été hybridée pendant une nuit à 4°C avec : (i) l’immun-sérum N° 20033168 dilué au
1/300, 1/1000 et 1/3000 dans le tampon PBS/BSA 1%/Tween 0,1%, (ii) le sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) dilué
au 1/50000 dans le même tampon et (iii) le sérum du lapin P11135 (sérum anti-S) dilué au 1/10000 dans le même
tampon. Après lavage en PBS/Tween, une hybridation secondaire a été réalisée à l’aide, soit d’anticorps polyclonaux
de mouton dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G humaines et couplés à la peroxidase
(NA933V, Amersham), soit d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés à l’aide du kit
ECL+ (Amersham) et de films d’autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham). Une échelle de masse moléculaire (kDa)
est portée sur la figure.
3) Résultats
[0226] La figure 7 montre que trois polypeptides de masse moléculaire apparente 35, 55 et 200 kDa sont détectés
spécifiquement dans les extraits de cellules infectées par le SARS-CoV.
[0227] Afin d’identifier ces polypeptides, deux autres immunoempreintes (figure 8) ont été réalisées sur les mêmes
échantillons et dans les mêmes conditions avec des anticorps polyclonaux de lapins spécifique de la nucléoprotéine N
(lapin P13097, figure 8A) et de la protéine de spicule S (lapin P11135, figure 8B) Cette expérience montre que le
polypeptide de 200 kDa correspond à la glycoprotéine de spicule S du SARS-CoV, que le polypeptide de 55 kDa
correspond à la nucléoprotéine N tandis que le polypeptide de 35 kDa représente vraisemblablement une forme tronquée
ou dégradée de la N.
[0228] Les données présentées dans la figure 7 montrent donc que le sérum 20033168 réagit fortement avec la N et
beaucoup plus faiblement avec la S du SARS-CoV, puisque les polypeptides de 35 et 55 kDa sont révélés sous la forme
de bandes intenses pour des dilutions de 1/300, 1/1000 et 1/3000 de l’immunsérum alors que le polypeptide de 200
kDa n’est que faiblement révélé pour une dilution de 1/300. On peut noter également qu’aucun autre polypeptide du
SARS-CoV n’est détecté pour des dilutions supérieures au 1/300 du sérum 20033168.
[0229] Cette expérience indique que la réponse en anticorps spécifique de la N du SARS-CoV domine les réponses
en anticorps spécifiques des autres polypeptides du SARS-CoV et en particulier la réponse en anticorps dirigée contre
la glycoprotéine S. Elle indique une immunodominance de la nucléoprotéine N lors des infections humaines par le SARSCoV.

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