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EP 1 694 829 B1
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55°C, 2 min à 94°C suivi de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 10 sec, une étape
d’hybridation à 55°C pendant 30 sec et une étape d’élongation à 68°C pendant 45 sec, avec 3 sec d’incrément par cycle
et enfin une étape d’élongation terminale à 68°C pendant 7 min.
[0171] Les produits d’amplification ainsi obtenus (amplicons M et E) ont subi une deuxième amplification PCR (PCR
nichée) en utilisant le kit Expand High-Fi®, Roche), à l’aide des couples d’amorces :
-
10
15
20
25
30
35
40
S/E/F2/+/26082-26101 et S/E/R2/-/26413-26394 pour l’amplicon E, et
S/M/F2/+/26330-26350 et S/M/R2/-/27098-27078 pour l’amplicon M.
[0172] Le mélange réactionnel contenant : 2 Pl du produit de la première PCR, 39,25 Pl d’H2Oppi, 5 Pl de tampon
10X contenant du MgCl2, 2 Pl de dNTP (5mM), 0,5Pl de chacune des amorces (50 PM) et 0,75Pl de mélange d’enzyme
a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : une étape de dénaturation à 94°C pendant 2 min a
été suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 60°C
pendant 30 sec et une étape d’élongation à 72°C pendant 45 sec, avec 3 sec d’incrément par cycle, et enfin une étape
d’élongation terminale à 72°C pendant 7 min. Les produits d’amplification obtenus correspondant aux ADNc codant
pour les protéines E et M ont été séquencés comme ci-dessus, à l’aide des amorces : S/E/F2/+/26082 et S/E/R2/-/
26394, S/M/F2/+/26330, S/M/R2/-/27078 précitées et des amorces S/M/+/26636-26655 et S/M/-/26567-26548. Ils ont
ensuite été clonés, comme ci-dessus, pour donner les plasmides dénommés SARS-E et SARS-M. L’ADN de ces clones
a ensuite été isolé et séquencé à l’aide des amorces universelles M13 forward et M13 reverse ainsi que des amorces
S/M/+/26636 et S/M/-/26548 précitées.
[0173] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc codant pour la protéine E (SEQ ID NO : 13) de la souche de
SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes
des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani. La séquence de la protéine E de la souche de SARS-CoV 031589
correspond à la séquence SEQ ID NO : 14 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0174] Le plasmide, dénommé SARS-E a été déposé sous le n° I-3046, le 28 mai 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient la séquence
d’ADNc codant pour la protéine E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle
que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26082 à 26413 (SEQ ID NO :
15), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
[0175] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc codant pour la M (SEQ ID NO :16) de la souche de SARSCoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par rapport à la séquence correspondante de
l’isolat AY274119.3-Tor2. En revanche, en position 26857, l’isolat AY278741-Urbani comporte un c et la séquence de
la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n°031589 un t. Cette mutation aboutit à une modification
de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante: en position 154, une proline (AY278741-Urbani) est
changée en sérine dans la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n°031589. La séquence de
la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n°031589 correspond à la séquence
SEQ ID NO :17 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0176] Le plasmide, dénommé SARS-M a été déposé sous le n° I-3047, le 28 mai 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient la séquence
d’ADNc codant pour la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle
que définie ci-dessus ; laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26330 à 27098 (SEQ ID NO :
18), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
2.3) ADNc correspondant aux ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11
45
[0177] La même stratégie d’amplification, de clonage et de séquençage a été utilisée pour obtenir les fragments
d’ADNc correspondant respectivement aux ORF suivantes: ORF 3, ORF4, ORF7, ORF8, ORF9, ORF10 et ORF11. Les
couples d’amorces utilisées pour la première amplification sont :
50
-
ORF3 et ORF4 : S/SE/F1/+/25069-25088 et S/SE/R1/-/26300-26281
ORF7 à ORF11 : S/MN/F1/+/26898-26917 et S/MN/R1/-/28287-28266
[0178]
55
-
Les couples d’amorces utilisées pour la deuxième amplification sont :
ORF3 et ORF4 : S/SE/F2/+/25110-25129 et S/SE/R2/-/26244-26225
ORF7 à ORF11 : S/MN/F2/+/26977-26996 et S/MN/R2/-/28218-28199
[0179]
Les conditions de la première amplification (RT-PCR) sont les suivantes : 45 min à 42°C, 10 min à 55°C, 2
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