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EP 1 694 829 B1
2. Amplification, séquençage et clonage des ADNc
2.1) ADNc codant pour la protéine S
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[0157] Les ARN extraits à partir du prélèvement ont été soumis à une transcription inverse à l’aide d’oligonucléotides
hexamériques de séquence aléatoire (pdN6), afin de produire des fragments d’ADNc.
[0158] La séquence codant pour la glycoprotéine S du SARS-CoV a été amplifiée sous la forme de deux fragments
d’ADN chevauchants : fragment 5’ (SRAS-Sa, SEQ ID NO:5) et fragment 3’(SRAS-Sb, SEQ ID NO:6), en réalisant deux
amplifications successives à l’aide d’amorces imbriquées. Les amplicons ainsi obtenus ont été séquencés, clonés dans
le vecteur plasmidique PCR 2.1-TOPO™ (IN VITROGEN), puis la séquence des ADNc clonés a été déterminée.
a)clonage et séquençage des fragments Sa et Sb

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a1) synthèse de l’ADNc
[0159] Le mélange réactionnel contenant : ARN (5 Pl) , H2O ppi (3,5 Pl), tampon de transcriptase inverse5X (4 Pl,),
dNTP 5 mM (2 Pl), pdN6 100 ug/ml (4 Pl), RNasin 40 UI/ul (0,5 Pl) et transcriptase inverse AMV-RT, 10 UI/ul, PROMEGA
(1Pl) a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : 45 min à 42°C, 15 min à 55°C, 5 min à 95°C,
puis l’ADNc obtenu a été maintenu à +4°C.

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a2) première amplification PCR

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[0160] Les extrémités 5’ et 3’ du gène S ont été amplifiées respectivement avec les paires d’amorces S/Fl/+/
21350-21372 et S/R1/-/ 23518-23498, S/F3/+/ 23258-23277 et S/R3/-/25382-25363. Le mélange réactionnel de 50 Pl
contenant : ADNc (2 Pl), amorces 50 PM (0,5 Pl), tampon 10 X (5 Pl), dNTP 5 mM (2 Pl), Taq Expand High Fidelity,
Roche (0,75 Pl) et H20 (39, 75 Pl) a été amplifié dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes : une étape initiale
de dénaturation à 94°C pendant 2 min a été suivie de 40 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant
30 sec, une étape d’hybridation à 55°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 2 min 30 sec, avec
10 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, puis d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min.

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a3) deuxième amplification PCR

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[0161] Les produits de la première amplification PCR (amplicons 5’ et 3’) ont subi une seconde étape d’amplification
PCR (PCR nichée) dans des conditions identiques à celles de la première amplification, avec les paires d’amorces
S/F2/+/21406-21426 et S/R2/-/23454-23435, et S/F4/+/23322-23341 et S/R4/-/25348-25329, respectivement pour l’amplicon 5’ et l’amplicon 3’.
a4) clonage et séguençage des fragments Sa et Sb

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[0162] Les amplicons Sa (extrémité 5’) et Sb (extrémité 3’) ainsi obtenus ont été purifiés à l’aide du kit QIAquick PCR
purification (QIAGEN), en suivant les recommandations du fabricant, puis ils ont été clonés dans le vecteur PCR2.1TOPO (kit Invitrogen), pour donner les plasmides dénommés SRAS-S1 et SRAS-S2.
[0163] L’ADN des clones Sa et Sb a été isolé puis l’insert correspondant a été séquencé à l’aide du Kit Big Dye,
Applied Biosystem® et des amorces universelles M13 forward et M13 reverse, ainsi que des amorces : S/S/+/21867,
S/S/+/22353, S/S/+/22811, S/S/+/23754, S/S/+/24207, S/S/+/24699, S/S/+/24348, S/S/-/24209, S/S/-/23630, S/S/-/
23038, S/S/-/22454, S/S/-/21815, S/S/-/24784, S/S/+/21556, S/S/+/23130 et S/S/+/24465, en suivant les instructions
du fabricant ; les séquences des fragments Sa et Sb ainsi obtenues correspondent aux séquences SEQ ID NO :5 et
SEQ ID NO :6 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0164] Le plasmide, dénommé SARS-S1 a été déposé sous le n° I-3020, le 12 mai 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient un fragment 5’
de la séquence du gène S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que
définie ci-dessus, lequel fragment dénommé Sa correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 23454 (SEQ ID
NO :5), en référence à la séquence Genbank AY274119.3 Tor2.
[0165] Le plasmide, dénommé TOP10F’-SARS-S2 a été déposé sous le n° I-3019, le 12 mai 2003, auprès de la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient un
fragment 3’de la séquence du gène S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589,
telle que définie ci-dessus, lequel fragment dénommé Sb correspondant aux nucléotides des positions 23322 à 25348
(SEQ ID NO : 6), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.

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