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EP 1 694 829 B1

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CoV issue du prélèvement n°031589a été séquencé à l’aide des amorces: S/N/F4/+/28054, S/N/R4/-/29430, S/N/+/
28468, S/N/+/28918 et S/N/-/28607 et cloné comme ci-dessus pour les autres ORF, pour donner le plasmide dénommé
SARS-N. L’ADN de ces clones a été isolé et séquencé à l’aide des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens,
ainsi que des amorces S/N/+/28468, S/N/+/28918 et S/N/-/28607.
[0191] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-N et incluant les ORF13 et ORF14
(SEQ ID NO :36) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par
rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani. La séquence de la protéine
N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspond à la séquence SEQ ID NO : 37 dans la liste
de séquences jointe en annexe.
[0192] Les séquences des ORF13 et 14 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspondent
respectivement aux séquences SEQ ID NO : 32 et 34 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0193] Le plasmide dénommé SARS-N a été déposé sous le n° I-3048, le 5 juin 2003, auprès de la Collection Nationale
de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient l’ADNc codant pour la
protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus,
laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 28054 à 29430 (SEQ ID NO :38), en référence à la
séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
2.5) extrémités 5’ et 3’ non-codantes

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a) extrémité 5’non-codante (5’NC)
a1) synthèse de l’ADNc

25

30

35

40

45

50

55

[0194] Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse
dans les conditions suivantes :
[0195] L’ARN (15 Pl) et l’amorce S/L/-/443 (3 Pl à la concentration de 5Pm, ont été incubés 10 min à 75°C.
[0196] Ensuite, du Tampon de transcriptase inverse 5X (6 Pl, INVITROGEN), des dNTP 10 mM (1 Pl), du DTT 0,1M
(3 Pl) ont été ajoutés et le mélange a été incubé à 50°C pendant 3 min.
[0197] Enfin la transcriptase inverse (3 Pl de Superscript®, INVITROGEN) a été ajoutée au mélange précédent qui
a été incubé à 50°C pendant 1h30 puis à 90 °C pendant 2 min.
[0198] L’ADNc ainsi obtenu a été purifié à l’aide du kit QIAquick PCR purification (QIAGEN), selon les recommandations
du fabricant.
b1) Réaction à la Terminal Transferase (TdT)
[0199] L’ADNc (10 Pl) est incubé 2 min à 100°C, conservé dans la glace, puis sont ajoutés : H20 (2,5 Pl), tampon TdT
5X (4 Pl, AMERSHAM), dATP 5mM (2 Pl) et TdT (1,5 Pl, AMERSHAM). Le mélange ainsi obtenu est incubé 45 min à
37°C puis 2 min à 65°C.
[0200] Le produit obtenu est amplifié par une première réaction PCR à l’aide des amorces : S/L/-/225-206 et ancre
14T : 5’-AGATGAATTCGGTACCTTTTTTTTTTTTTT-3’ (SEQ ID NO :68). Les conditions de l’amplification sont les
suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min est suivie de 10 cycles comprenant une étape de
dénaturation à 94°C pendant 10 sec, une étape d’hybridation à 45°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C
pendant 30 sec puis de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 10 sec, une étape d’hybridation
à 50°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 30 sec, puis d’une étape finale d’élongation à 72°C
pendant 5 min.
[0201] Le produit de la première amplification PCR a subi une seconde étape d’amplification à l’aide des amorces :
S/L/-/204-185 et ancre 14T précitée dans des conditions identiques à celles de la première amplification. L’amplicon
ainsi obtenu a été purifié, séquencé à l’aide de l’amorce S/L/-/182-163 puis il a été cloné comme ci-dessus pour les
différentes ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-5’NC. L’ADN de ce clone a été isolé et séquencé à l’aide
des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens et de l’amorce S/L/-/182-163 précitée.
[0202] L’amplicon représentant l’ADNc correspondant à l’extrémité 5’NC de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO : 72 dans la liste de séquences jointe en
annexe ; cette séquence ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats
AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani.
[0203] Le plasmide dénommé SARS-5’NC a été déposé sous le n° I- 3124, le 7 novembre 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient l’ADNc correspondant à l’extrémité 5’non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le
n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 1 à 204 (SEQ

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