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EP 1 694 829 B1

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min à 94°C suivi de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation
à 58°C pendant 30 sec et une étape d’élongation à 68°C pendant 1 min, avec 5 sec d’incrément par cycle et enfin une
étape d’élongation terminale à 68°C pendant 7 min.
Les conditions de la PCR nichée sont les suivantes : une étape de dénaturation à 94°C pendant 2 min a été suivie de
40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, une étape d’hybridation à 58°C pendant 30
sec et une étape d’élongation à 72°C pendant 50 sec, avec 4 sec d’incrément par cycle et enfin une étape d’élongation
terminale à 72°C pendant 7 min.
[0180] Les produits d’amplification obtenus correspondant aux ADNc contenant respectivement les ORF3 et 4 et les
ORF7 à 11 ont été séquencés à l’aide des amorces : S/SE/+/25363, S/SE/+/25835, S/SE/-/25494, S/SE/-/25875, S/MN/
+/27839, S/MN/+/27409, S/MN/-/27836 S/MN/-/27799 et clonés comme ci-dessus pour les autres ORF, pour donner
les plasmides dénommés SARS-SE et SARS-MN. L’ADN de ces clones a été isolé et séquencé à l’aide de ces mêmes
amorces et des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens.
[0181] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc de la région contenant les ORF 3 et 4 (SEQ ID NO :7) de la
souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 comporte une différence nucléotidique par rapport à la séquence
correspondante de l’isolat AY274119-Tor2. Cette mutation en position 25298 aboutit à une modification de la séquence
en acides aminés de la protéine correspondante (ORF 3): en position 11, une arginine (AY274119-Tor2) est changée
en glycine dans la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589. En revanche, aucune mutation n’a été
identifiée par rapport à la séquence correspondante de l’isolat AY278741-Urbani. Les séquences des ORF 3 et 4 la
souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO :10
et 12 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0182] Le plasmide, dénommé SARS-SE a été déposé sous le n° I-3126, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient l’ADNc correspondant à la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant l’ORF-E de la souche de SARS-CoV issue du
prélèvement répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle région correspondant aux nucléotides
des positions 25110 à 26244 (SEQ ID NO :8), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3,
[0183] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc correspondant à la région contenant les ORF7 à ORF11 (SEQ
ID NO :19) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par rapport
aux séquences correspondantes des isolats AY274119-Tor2 et AY278741-Urbani. Les séquences des ORF7 à 11 de
la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO :
22, 24, 26, 28 et 30 dans la liste de séquences jointe en annexe.
[0184] Le plasmide dénommé SARS-MN a été déposé sous le n° I-3125, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; il contient la séquence
d’ADNc correspondant à la région située entre l’ORF-M et l’ORF-N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement
répertorié sous le n° 031589 et prélevée à Hanoi, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux
nucléotides des positions 26977 à 28218 (SEQ ID NO :20 ), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
[0185] La séquence de l’amplicon représentant l’ADNc correspondant à la région contenant les ORF7 à ORF11 (SEQ
ID NO :19) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 ne comporte pas de différences par rapport
aux séquences correspondantes des isolats AY274119-Tor2 et AY278741-Urbani. Les séquences des ORF7 à 11 de
la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n°031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO :
22, 24, 26, 28 et 30 dans la liste de séquences jointe en annexe.
2.4) ADNc codant pour la protéine N et incluant les ORF13 et ORF14

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[0186] L’ADNc a été synthétisé et amplifié comme décrit ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. De manière plus
précise, le mélange réactionnel contenant : 5 Pl d’ARN, 5 Pl d’H2O ppi 4 Pl de tampon de reverse transcriptase 5X, 2
Pl de dNTP (5 mM), 2 Pl d’oligo 20T (5 PM), 0,5 Pl de RNasin (40 UI/ul) et 1, 5 Pl de AMV-RT (10 UI/ul Promega) a été
incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : 45 min à 42°C, 15 min à 55°C, 5 min à 95°C, puis il a été
maintenu à +4°C.
[0187] Une première amplification PCR a été réalisée avec la paire d’amorces S/N/F3/+/28023 et S/N/R3/-/29480.
[0188] Le mélange réactionnel comme ci-dessus pour l’amplification des fragments S1 et S2 a été incubé dans un
thermocycleur, dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min a été suivie de
40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, une étape d’hybridation à 55°C pendant 30
sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 1 min 30 sec avec 10 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle,
puis d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min.
[0189] L’amplicon obtenu à la première amplification PCR a subi une seconde étape d’amplification PCR (PCR nichée)
avec la paires d’amorce S/N/F4/+/28054 et S/N/R4/-/29430 dans des conditions identiques à celles de la première
amplification.
[0190] Le produit d’amplification obtenu correspondant à l’ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-

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