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EP 1 694 829 B1

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tidique par rapport à la séquence correspondante de l’isolat AY278741-Urbani. Cette mutation t/c en position 7919
aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante, codée par l’ORF la: en
position 2552, une valine (codon gtt ; AY278741) est changée en alanine (codon gct) dans la souche de SARS-CoV
031589. En revanche, aucune mutation n’a été identifiée par rapport à la séquence correspondante de l’isolat
AY274119.3-Tor2. Les autres fragments ne présentent pas de différences par rapport aux séquences correspondantes
des isolats Tor2 et Urbani.
Exemple 2 : Production et purification de protéines N et S recombinantes de la souche de SARS-CoV issue du
prélèvement répertorié sous le numéro 031589

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[0214] La protéine entière N et deux fragments polypeptidiques de la protéine S de la souche de SARS-CoV issue
du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 ont été produites chez E. coli, sous forme de protéines de fusion
comprenant une étiquette polyhistidine N-ou C-terminale. Dans les deux polypeptides S, les séquences hydrophobes
N et C-terminales de la protéine S (peptide signal : positions 1 à 13 et hélice transmembranaire : positions 1196 à 1218)
ont été délétées alors que l’hélice β (positions 565 à 687) et les deux motifs de type coiled-coils (positions 895 à 980 et
1155 à 1186) de la protéine S ont été préservés. Ces deux polypeptides sont constitués par : un fragment long (SL)
correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S et un fragment court (SC)
correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S. 1) Clonage des ADNc N,
SL et SC dans les vecteurs d’expression pIVEX2.3 et
pIVEX2.4

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[0215] Les ADNc correspondant à la protéine N et aux fragments SL et SC ont été amplifiés par PCR dans des
conditions standard, à l’aide de l’ADN polymérase Platinium Pfx® (INVITROGEN). Les plasmides SRAS-N et SRAS-S
ont été utilisés comme matrice et les oligonucléotides suivants comme amorces :
5’-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3’ (N sens, SEQ ID NO :55)
5’-CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3’ (N antisens, SEQ ID NO :56)
5’-CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3’ (SC sens, SEQ ID NO :57)
5’-CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3’ (SL sens, SEQ ID NO :58)
5’-CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC-3’ (SC et SL antisens, SEQ ID NO :59).
[0216] Les amorces sens introduisent un site NdeI (souligné) alors que les amorces antisens introduisent un site XmaI
ou SmaI (souligné). Les 3 produits d’amplification on été purifiés sur colonne (kit QIAquick PCR Purification, QIAGEN)
et clonés dans un vecteur approprié. L’ADN plasmidique purifié des 3 constructions (kit QIAFilter Midi Plasmid, QIAGEN)
a été vérifié par séquençage et digéré par les enzymes NdeI et XmaI. Les 3 fragments correspondants aux ADNc N,
SL et SC ont été purifiés sur gel d’agarose puis insérés dans les plasmides pIVEX2.3MCS (étiquette polyhistidine Cterminale) et pIVEX2.4d (étiquette polyhistidine N-terminale) préalablement digérés par les mêmes enzymes. Après
vérification des constructions, les 6 vecteurs d’expressions ainsi obtenus (pIV2.3N, pIV2.3SC, pIV2.3SL, pIV2.4N,
pIV2.4SC également dénommé pIV2.4SI, pIV2.4SL) ont été ensuite utilisés, d’une part pour tester l’expression des
protéines in-vitro, et d’autre part pour transformer la souche bactérienne BL21(DE3)pDIA17 (NOVAGEN). Ces constructions codent pour des protéines dont la masse moléculaire attendue est la suivante : pIV2.3N (47174 Da), pIV2.3SC
(82897 Da), pIV2.3SL (132056 Da), pIV2.4N (48996 Da), pIV2.4SI (81076 Da) et pIV2.4SL(133877 Da). Des bactéries
transformées par pIV2.3N ont été déposées à la CNCM le 23 octobre 2003, sous le numéro I-3117, et des bactéries
transformées par pIV2.4SI ont été déposées à la CNCM le 23 octobre 2003, sous le numéro I-3118.
2) Analyse de l’expression des protéines recombinantes in-vitro et in vivo

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[0217] L’expression de protéines recombinantes à partir des 6 vecteurs recombinants a été testée, dans un premier
temps, dans un système in-vitro (RTS100, Roche). Les protéines produites in vitro, après une incubation des vecteurs
recombinants pIVEX, 4h à 30°C, dans le système RTS100, ont été analysées par westem-blot à l’aide d’un anticorps
anti-(his)6 couplé à la péroxydase. Le résultat d’expression in-vitro (Figure 1) montre que seule la protéine N est exprimée
en quantités importantes, cela quelle que soit la position, N- ou C-terminale, de l’étiquette polyhistidine. Dans une
seconde étape, l’expression des protéines N et S a été testée in-vivo à 30°C dans du milieu LB, en présence ou en
l’absence d’inducteur (IPTG 1mM). La protéine N est très bien produite dans ce système bactérien (Figure 2) et se
retrouve principalement dans une fraction soluble après lyse des bactéries. En revanche, la version longue de S (SL)
est très peu produite et complètement insoluble (Figure 3). La version courte (SC) présente également une très faible
solubilité, mais un taux d’expression beaucoup plus élevé que celui de la version longue. Par ailleurs, la construction

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