EP1694829B1.pdf

EP 1 694 829 B1
(suite)

5

10

15

20

Amorce sens RTPCR

Amorce antisens
RT-PCR

Amorce sens PCR
nichée

Amorce antisens
PCR nichée

L5 7296-9156

S/L5/F1/+7111

S/L5/R1/-9253

S/L5/F2/+7275

S/L5/R2/-9157

L6 9053-11066

S/L6/F1/+8975

S/L6/R1/-11151

S/L6/F2/+9032

S/L6/R2/-11067

L7 10928-12962

S/L7/F1/+10883

S/L7/R1/-13050

S/L7/F2/+10928

S/L7/R2/-12963

L8 12835-14834

S/L8/F1/+12690

S/L8/R1/-14857

S/L8/F2/+12815

S/L8/R2/-14835

L9 14765-16624

S/L9/F1/+14688

S/L9/R1/-16678

S/L9/F2/+14745

S/L9/R2/-16625

L10 16534-18570

S/L10/P1/+16451

S/L10/R1/-18594

S/L10/F2/+16514

S/L10/R2/-18571

L11 18521-20582

S/L11/F1/+18441

S/L11/R1/-20612

S/L11/F2/+18500

S/L11/R2/-20583

L12 20338-22205.

S/L12/F1/+20279

S/L12/R1/-22229

S/L12/F2/+20319

S/L12/R2/-22206

[0211] Tous les fragments ont été amplifiés dans les conditions suivantes, excepté le fragment L0 qui a été amplifié
comme décrit ci-dessus pour l’ORF-M :
-

RT-PCR: 30 min à 42°C, 15 min à 55°C, 2 min à 94°C, puis l’ADNc obtenu est amplifié dans les conditions suivantes :
40 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 58°C pendant
30 sec puis une étape d’élongation à 68°C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d’élongation supplémentaire à chaque
cycle, puis une étape finale d’élongation à 68°C pendant 7 min.

-

PCR nichée : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min est suivie de 3 cycles comprenant : une étape
de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 60°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation
à 72°C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, puis une étape finale
d’élongation à 72°C pendant 7 min.

25

30

REGION
AMPLIFIEE ET
SEQUENCEE (ne
tient pas compte
des amorces)

[0212]
35

Les produits d’amplifications ont été séquencés à l’aide des amorces définies dans le Tableau III ci-après :
Tableau III : Amorces utilisées pour le séquençage de la région 5’ (ORF1a et ORF1b)
Noms

40

45

50

55

S/L3/+/4932
S/L4/+/6401
S/L4/+/6964
S/L4/-/6817
S/L5/-/7633
S/L5/-/8127
S/L5/-/8633
S/L5/+/7839
S/L5/+/8785
S/L5/+/8255
S/L6/-/9422
S/L6/-/9966
S/L6/-/10542
S/L6/+/10677
S/L6/+/10106
S/L6/+/9571
S/L7/-/11271
S/L7/-/11801

Séquences (SEQ ID NO : 76 à 139)
5’-CCACACACAGCTTGTGGATA-3’
5’-CCGAAGTTGTAGGCAATGTC-3’
5’-TTTGGTGCTCCTTCTTATTG-3’
5’-CCGGCATCCAAACATAATTT-3’
5’-TGGTCAGTAGGGTTGATTGG-3’
5’-CATCCTTTGTGTCAACATCG-3’
5’-GTCACGAGTGACACCATCCT-3’
5’-ATGCGACGAGTCTGCTTCTA-3’
5’-TTCATAGTGCCTGGCTTACC-3’
5’-ATCTTGGCGCATGTATTGAC-3’
5’-TGCATTAGCAGCAACAACAT-3’
5’-TCTGCAGAACAGCAGAAGTG-3’
5’-CCTGTGCAGTTTGTCTGTCA-3’
5’-CCTTGTGGCAATGAAGTACA-3’
5’-ATGTCATTTGCACAGCAGAA-3’
5’-CTTCAATGGTTTGCCATGTT-3’
5’-TGCGAGCTGTCATGAGAATA-3’
5’-AACCGAGAGCAGTACCACAG-3’

31