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EP 1 694 829 B1
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A. Des pools de sérums immuns prélevés 3 semaines après chacune des deux immunisations ont été réalisés
pour chacun des groupes et ont été analysés par ELISA indirect en utilisant un lysat de cellules VeroE6 infectées
par le SRAS-CoV comme antigène. Les titres en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de
la dilution produisant une DO spécifique de 0,5 après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG de souris
couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) et du TMB (KPL).
B. Les pools de sérums immuns ont été évalués pour leur capacité à séroneutraliser l’infectivité de 100 TCID50
du SRAS-CoV sur cellules FRhK-4. 4 points sont réalisés pour chacune des dilutions de raison 2 testées à
partir du 1/20. Le titre séroneutralisant est calculé selon la méthode de Reed et Munsch comme l’inverse de la
dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4.
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la figure 40 décrit la construction des virus recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol.
A. Le vecteur rougeole est un génome complet de la souche vaccinale Schwarz du virus de la rougeole (MV)
dans lequel une unité de transcription supplémentaire a été introduite (Combredet, 2003, Journal of Virology,
77 : 11546-11554). L’expression des phases ouvertes de lecture (ORF) supplémentaires est contrôlée par les
éléments agissant en cis nécessaires à la transcription, à la formation de la coiffe et à la polyadénylation du
transgène, qui ont été copiés des éléments présents à la jonction N/P. 2 vecteurs différents permettent l’insertion
entre les gènes P (phosphoprotéine) et M (matrice) d’une part et H (hémagglutinine) et L (polymérase) d’autre
part.
B. Les génomes recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol du virus de la rougeole ont été
construits par l’insertion des ORFs de la protéine S et du polypeptide Ssol au sein d’une unité de transcription
supplémentaire localisée entre les gènes P et M du vecteur.
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Les différents gènes du virus de la rougeole (MV) sont indiqués : N (nucléoprotéine), PVC (phosphoprotéine
et protéine V/C), M (matrice), F (fusion), H (hémagglutinine), L (polymérase). T7 = promoteur de l’ARN
polymérase T7, hh = ribozyme hammerhead, T7t = séquence terminatrice de l’ARN polymérase du phage
T7, ∂ = ribozyme du virus de l’hépatite ∂, (2), (3) = unités de transcription supplémentaires (ATU).
Taille du génome du MV : 15894 nt.
SP : peptide signal
TM : région transmembranaire
FLAG : étiquette FLAG
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la figure 41 illustre l’expression de la protéine S par les virus rougeole recombinants, analysée par western blot.
Des extraits cytoplasmiques ont été préparés après infection de cellules Vero par différents passages des virus
MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol et le virus sauvage MWSchw à titre de contrôle. Des extraits
cellulaires en tampon de dépôt selon Laemmli ont également été préparés 8 heures après infection de cellules
VeroE6 par le SRAS-CoV à une multiplicité d’infection de 3. Ils ont été séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide
et analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal antiIgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham).
Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
Pn : nième passage du virus après coculture de cellules 293-3-46 et Vero.
SRAS-CoV : extrait de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV
Mock : extrait contrôle de cellules VeroE6 non infectées
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sérums de cas probables de SRAS sont identifiés par un numéro d’ordre du Centre National de Référence des
Virus Influenzae ainsi que par les initiales du patient et le nombre de jours écoulés depuis le début des symptômes,
le cas échéant. Les sérums TV sont des sérums témoins de sujets qui ont été prélevés en France avant l’épidémie
de SRAS survenue en 2003.
la figure 39 montre la réponse en anticorps anti-SRAS-CoV chez la souris après immunisation par les virus vaccine
recombinants. Des groupes de 7 souris BALB/c ont été immunisés par voie i.v. à deux reprises à 4 semaines
d’intervalle par 106 u.f.p. de virus vaccine recombinants VV-TG, VV-TG-HA, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VVTN-S, VV-TN-Ssol.
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la figure 42 montre l’expression de la protéine S par les virus rougeole recombinants, analysée par immunofluorescence
Des cellules Vero en monocouches sur lamelles de verre ont été infectées par le virus sauvage MWSchw (A) ou
les virus MVSchw2-SARS-S (B) et MVSchw2-SARS-Ssol (C). Quand les syncytia ont atteint 30 à 40% de confluence
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