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EP 1 694 829 B1

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[0026] La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa
séquence est celle du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus.
[0027] Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide il présente la séquence SEQ ID NO : 1.
[0028] Les Inventeurs décrivent également un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence
hybride dans des conditions de forte stringence avec la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus.
[0029] Les termes « isolé ou purifié » signifient modifié « par la main de l’homme » à partir de l’état naturel ; autrement
dit si un objet existe dans la nature, il est dit isolé ou purifié s’il a été modifié ou extrait de son environnement naturel
ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou une protéine/un peptide naturellement présent dans un organisme vivant
n’est ni isolé, ni purifié ; en revanche le même polynucléotide ou protéine /peptide séparé des molécules coexistantes
dans son environnement naturel, obtenu par clonage, amplification et/ou synthèse chimique est isolé au sens de la
présente invention. De plus, un polynucléotide ou une protéine/peptide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par toute autre méthode, est « isolé » même s’il est présent dans ledit organisme.
Le terme purifié tel qu’utilisé dans la présente invention, signifie que les protéines /peptides selon l’invention sont
essentiellement libres d’association avec les autres protéines ou polypeptides, comme l’est par exemple le produit purifié
de la culture de cellules hôtes recombinantes ou le produit purifié à partir d’une source non-recombinante.
[0030] On entend par conditions d’hybridation de forte stringence, des conditions de température et de force ionique
choisies de telle manière qu’elles permettent le maintien de l’hybridation spécifique et sélective entre polynucléotides
complémentaires.
[0031] A titre d’illustration, des conditions de forte stringence aux fins de définir les polynucléotides ci-dessus, sont
avantageusement les suivantes : l’hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation
à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution
0,15 M NaCl + 0, 015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt’s,
5 % de dextran sulfate et 1 % d’ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation pendant 20 heures à 42°C suivie de 2
lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le
dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C.
[0032] Les Inventeurs décrivent également un fragment représentatif du polynucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il est susceptible d’être obtenu, soit par l’utilisation d’enzymes de restriction dont les sites de reconnaissance et de coupure sont présents dans ledit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par amplification à l’aide
d’amorces oligonucléotidiques spécifiques dudit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par transcription in vitro,
soit par synthèse chimique.
[0033] Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment, il est sélectionné dans le groupe constitué par :
l’ADNc correspondant à au moins un cadre ouvert de lecture (ORF) choisi parmi : ORF1a, ORF1b, ORF-S, ORF-E,
ORF-M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11, ORF 13 et ORF 14, et l’ADNc correspondant aux extrémités 5’ ou 3’
non-codantes dudit polynucléotide.
[0034] Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit fragment présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par :
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les séquences SEQ ID NO : 2 et 4 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-S qui code pour la protéine S,
les séquences SEQ ID NO : 13 et 15 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-E qui code pour la protéine E,
les séquences séquence SEQ ID NO: 16 et 18 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-M qui code pour la
protéine M,
les séquences SEQ ID NO : 36 et 38 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-N qui code pour la protéine N,
les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement : aux ORF1a et ORF1b (ORF1ab, SEQ ID
NO : 31), aux ORF3 et ORF4 (SEQ ID NO : 7, 8), aux ORF 7 à 11 (SEQ ID NO : 19, 20), à l’ORF13 (SEQ ID NO :
32) et à l’ORF 14 (SEQ ID NO : 34), et
les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement aux extrémités 5’(SEQ ID NO : 39 et 72) et
3’ non-codantes (SEQ ID NO : 40, 73) dudit polynucléotide.

[0035] Les Inventeurs décrivent également un fragment de l’ADNc codant pour la protéine S, tel que défini ci-dessus,
caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :
5 et 6 (fragments Sa et Sb).
[0036] Les Inventeurs décrivent également un fragment de l’ADNc correspondant aux ORF1a et ORF1b tel que défini
ci-dessus, caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ
ID NO : 41 à 54 (fragments L0 à L12).
[0037] Les Inventeurs décrivent également un fragment du polynucléotide tel que défini ci dessus, caractérisé en ce
qu’il présente au moins 15 bases ou paires de bases consécutives de la séquence du génome de ladite souche incluant
au moins une de celles situées en position 7979, 16622, 19064, 23220, 24872, 25298 et 26857. De préférence, il s’agit
d’un fragment de 20 à 2500 bases ou paires de bases, de manière préférée de 20 à 400.

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