EP1694829B1.pdf
Aperçu texte
EP 1 694 829 B1
A.Des groupes de 7 souris BALB/c ont été immunisés à deux reprises à 4 semaines d’intervalle à l’aide de 50
Pg d’ADN plasmidique de pCI, pcDNA-S, pCI-S, pcDNA-N et pCI-HA.
B. Des groupes de 6 souris BALB/c ont été immunisés à deux reprises à 4 semaines d’intervalle à l’aide de 2
Pg, 10Pg ou 50 Pg d’ADN plasmidique de pCI, pCI-S, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE.
5
10
-
15
A. Groupes de souris BALB/c immunisés à deux reprises à 4 semaines d’intervalle à l’aide de 50 Pg d’ADN
plasmidique de pCI, pcDNA-S, pCI-S, pcDNA-N et pCI-HA. K : sérum préimmun. ■ : sérum immun.
B. Groupes de souris BALB/c immunisés à deux reprises à 4 semaines d’intervalle à l’aide de 2 Pg, 10Pg ou
50 Pg d’ADN plasmidique de pCI, pCI-S, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE.
20
25
30
-
35
40
-
45
50
-
55
Les sérums immuns prélevés 3 semaines après la deuxième immunisation ont été analysés par ELISA indirect en
utilisant un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme antigène. Les titres en anticorps anti-SRASCoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO spécifique de 0,5 après révélation par un
anticorps polyclonal anti-IgG de souris couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) et du TMB (KPL).
la figure 29 montre la séroneutralisation de l’infectivité du SRAS-CoV par les anticorps induits chez la souris après
immunisation génique à l’aide d’ADN plasmidique codant la S du SRAS-CoV. Des pools de sérums immuns prélevés
3 semaines après la deuxième immunisation ont été réalisés pour chacun des groupes des expériences décrites
dans la figure 28 et évalués pour leur capacité à séroneutraliser l’infectivité de 100 TCID50 du SRAS-CoV sur
cellules FRhK-4. 4 points sont réalisés pour chacune des dilutions de raison 2 testées à partir du 1/20. Le titre
séroneutralisant est calculé selon la méthode de Reed et Munsch comme l’inverse de la dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4.
la figure 30 illustre l’immunoréactivité du polypeptide recombinant Ssol vis à vis de sérums de patients atteints de
SRAS. La réactivité de sérums de patients a été analysée par test ELISA indirect contre des phases solides préparées
à l’aide du polypeptide recombinant Ssol purifié. Les anticorps de patients réagissant avec la phase solide à une
dilution de 1/400 sont révélés par un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) humain couplé à la peroxidase (Amersham
NA933V) et du TMB plus H2O2 (KPL). Les sérums de cas probables de SRAS sont identifiés par un numéro d’ordre
du Centre National de Référence des Virus Influenzae ainsi que par les initiales du patient et le nombre de jours
écoulés depuis le début des symptômes, le cas échéant. Les sérums TV sont des sérums témoins de sujets qui
ont été prélevés en France avant l’épidémie de SRAS survenue en 2003.
La figure 31 montre l’induction d’anticorps dirigés contre le SRAS-CoV après immunisation avec le polypeptide
recombinant Ssol. Deux groupe de 6 souris ont été immunisés à 3 semaines d’intervalle avec 10 Pg de polypeptide
recombinant Ssol (groupe Ssol) adjuvé avec de l’hydroxyde d’aluminium ou, à titre de contrôle, de l’adjuvant seul
(groupe mock).Trois immunisations successives ont été réalisées et les sérums immuns ont été prélevés 3 semaines
après chacune des trois immunisations (IS1, IS2, IS3). Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun
des 2 groupes par ELISA indirect en utilisant un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme
antigène. Les titres en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO
spécifique de 0,5 après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG de souris couplé à la peroxidase (Amersham)
et du TMB (KPL).
La figure 32 présente l’alignement nucléotidique des séquences du gène synthétique 040530 avec la séquence du
gène sauvage de l’isolat 031589 du SRAS-CoV. I-3059 correspond aux nucléotides 21406-25348 de l’isolat 031589
du SRAS-CoV déposé à la C.N.C.M. sous le numéro I-3059 (SEQ ID NO : 4, plasmide pSRAS-S). S-040530 est la
séquence du gène synthétique 040530.
la figure 33 illustre l’utilisation d’un gène synthétique pour l’expression de la S du SRAS-CoV. Des extraits cellulaires
préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6 (A) ou 293T (B) par les plasmides pCI, pCI-S, pCI-S-CTE,
pCI-S-WPRE et pCI-Ssynth ont été séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide
d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase
(NA934V, Amersham). Le western blot est révélé par luminescence (ECL+, Amersham) et acquisition sur un dispositif
d’imagerie numérique (FluorS, BioRad). Les niveaux d’expression de la protéine S ont été mesurés en quantifiant
les 2 bandes majoritaires repérées sur l’image.
la figure 34 présente un schéma de la construction des virus vaccine recombinants VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TNS et VV-TN-Ssol
A. Les cDNA de la protéine S et du polypeptide Ssol du SRAS-CoV ont été inséré entre les sites BamH1 et
Sma1 du plasmide de transfert pTG186 pour obtenir les plasmides pTG-S et pTG-Ssol.
B. Les séquences du promoteur synthétique 480 ont ensuite été substituées à celles du promoteur 7.5 par
échange du fragment Nde1-Pst1 des plasmides pTG186poly, pTG-S et pTG-Ssol pour obtenir les plasmides
de transfert pTN480, pTN-S et pTN -Ssol.
21