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EP 1 694 829 B1

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comme anticorps témoin positif. Les anticorps paral-3 dirigé contre les antigènes des virus parainfluenza de type
1-3 (Bio-Rad) et grippe B dirigé contre les antigènes du virus de la grippe de type B (Bio-Rad) ont été ajoutés au
panel des anticorps monoclonaux testés.
la figure 20 montre un test de réactivité des anticorps monoclonaux anti-N du SRAS-CoV par western blot sur la
nucléoprotéine N native du SRAS-CoV dénaturée. Un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV a été
préparé dans le tampon de dépôt selon Laemmli et mis à migrer dans un gel SDS à 12% de polyacrylamide puis
les protéines ont été transférées sur membrane de PVDF. Les anticorps monoclonaux anti-N testés ont été utilisés
pour l’immunoessai à la concentration de 0.05 Pg/ml. La révélation est faite avec des anticorps anti-IgG(H+L) de
souris couplés à la peroxydase (NA93IV, Amersham) et le système ECL+. Deux anticorps monoclonaux ont été
utilisés comme témoins négatifs de réactivité : grippe B dirigé contre les antigènes du virus de la grippe de type B
(Bio-Rad) et para1-3 dirigé contre les antigènes des virus parainfluenza de type 1-3 (Bio-Rad).
la figure 21 présente les plasmides d’expression en cellules de mammifères de la protéine S du SRAS-CoV. Le
cDNA de la S du SRAS-CoV a été inséré entre les sites BamH1 et Xho1 du plasmide d’expression pcDNA3.1(+)
(Clontech) pour obtenir le plasmide pcDNA-S et entre les sites Nhe1 et Xho1 du plasmide d’expression pCI (Promega)
pour obtenir le plasmide pCI-S. Les séquences WPRE et CTE ont été insérées dans chacun des deux plasmides
pcDNA-S et pCI-S entre les sites Xho1 et Xba1 pour obtenir respectivement les plasmides pcDNA-S-CTE, pcDNAS-WPRE, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE.
SP : peptide signal prédit (aa 1-13) avec le logiciel signalP v2.0 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering, 10 : 1-6)
TM : région transmembranaire prédite (aa 1196-1218) avec le logiciel TMHMM v2.0 (Sonnhammer et al., 1998,
Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182, AAAI Press). Il faut noter que
les acides aminés W1194 et P1195 font possiblement partie de la région transmembranaire avec des probabilités
respectives de 0,13 et 0,42
P-CMV : promoteur immédiat/précoce du cytomégalovirus. BGH pA : signal de polyadénylation du gène de
l’hormone de croissance bovine
SV40 late pA : signal de polyadénylation tardif du virus SV40
SD/SA : sites donneur et accepteur d’épissage
WPRE : séquences du "Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element" du virus de l’hépatite
de la marmotte
CTE : séquences du "constitutive transport element" du rétrovirus simien de Mason-Pfizer

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la figure 22 illustre l’expression de la protéine S après transfection de cellules VeroE6. Des extraits cellulaires ont
été préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6 par les plasmides pcDNA, pcDNA-S, pCI et pCI-S.
Des extraits cellulaires ont également été préparés 18 heures après infection par le virus recombinant de la vaccine
VV-TF7.3 et transfection par les plasmides pcDNA ou pcDNA-S. A titre de contrôle, des extraits de cellules VeroE6
ont été préparés 8 heures après infection par le SRAS-CoV à une multiplicité d’infection de 3. Ils ont été séparés
sur un gel SDS à 8% d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et
d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham). Une échelle de
masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.

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SRAS-CoV : extrait de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV
Mock : extrait contrôle de cellules non infectées
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la figure 23 illustre l’effet des séquences CTE et WPRE sur l’expression de la protéine S après transfection de
cellules VeroE6 et 293T. Des extraits cellulaires ont été préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6
(A) ou 293T (B) par les plasmides pcDNA, pcDNA-S, pcDNA-S-CTE, pcDNA-S-WPRE, pCI-S, pCI-S-CTE et pCIS-WPRE, séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal
de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham).
Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.

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SRAS-CoV : extrait de cellules VeroE6 préparés 8 heures après infection par le SRAS-CoV à une multiplicité
d’infection de 3.
Mock : extrait contrôle de cellules VeroE6 non infectées
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la figure 24 présente des vecteurs lentiviraux défectifs à DNA flap central pour l’expression de la S du SRAS-CoV.
Le cADN de la protéine S du SRAS-CoV a été cloné sous la forme d’un fragment BamH1-Xho1 dans le plasmide
pTRIP∆U3-CMV contenant un vecteur lentiviral défectif TRIP à DNA flap central (Sirven et al, 2001, Mol. Ther., 3 :
438-448) pour obtenir le plasmide pTRIP-S. Les cassettes d’expression optimales constituées du promoteur immé-

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