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EP 1 694 829 B1

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non-humains, les anticorps humanisés sont moins immunogènes et possèdent une demi-vie prolongée chez l’Homme
car ils ne possèdent qu’une faible proportion de séquences non-humaines étant donné que la quasi-totalité des résidus
des régions FR (Framework) et de la région constante (Fc) de ces anticorps sont ceux d’une séquence consensus
d’immunoglobulines humaines.
[0090] Les Inventeurs décrivent également une puce ou filtre à protéine, caractérisé en ce qu’il comprend une protéine,
un peptide ou bien un anticorps tels que définis ci-dessus.
[0091] Les puces à protéine sont préparées par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Parmi les supports
appropriés sur lesquels peuvent être immobilisés des protéines, on peut citer ceux en matière plastique ou en verre,
notamment sous la forme de microplaques.
[0092] La présente invention a également pour objet des réactifs dérivés de la souche isolée de coronavirus associé
au SRAS, issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, utiles pour l’étude et le diagnostic de l’infection provoquée
par un coronavirus associé au SRAS, lesquels réactifs sont sélectionnés dans le groupe constitué par une souche isolée
de coronavirus et un polynucléotide tels que définis ci-dessus.
[0093] Les Inventeurs décrivent également des réactifs dérivés de la souche isolée de coronavirus associé au SRAS,
issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, utiles pour l’étude et le diagnostic de l’infection provoquée par un
coronavirus associé au SRAS, lesquels réactifs sont sélectionnés dans le groupe constitué par :
(a) une paire d’amorces, une sonde ou une puce à ADN telles que définies ci-dessus,
(b) un vecteur recombinant ou une cellule modifiée tels que définis ci-dessus,
(c) une protéine ou un peptide tel que défini ci-dessus,
(d) un anticorps ou fragment d’anticorps tels que définis ci-dessus, et
(e) une puce à protéine telle que définie ci-dessus.
[0094] Ces différents réactifs sont préparés et utilisés selon les techniques classiques de biologie moléculaire et
d’immunologie, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology
(Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA), dans Current Protocols in Immunology
(John E. Cologan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA) et dans Antibodies : A Laboratory Manual (E.
Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
[0095] Les fragments d’acide nucléique selon l’invention sont préparés et utilisés selon les techniques classiques
telles que définies ci-dessus. Les peptides et les protéines sont préparés par les techniques d’ADN recombinant, connues
de l’Homme du métier, notamment à l’aide des vecteurs recombinants tels que définis ci-dessus. Alternativement, les
peptides peuvent être préparés par les techniques classiques de synthèse en phase solide ou liquide, connues de
l’Homme du métier.
[0096] Les anticorps polyclonaux sont préparés par immunisation d’un animal approprié avec une protéine ou un
peptide tels que définis ci-dessus, éventuellement couplé à la KLH ou à l’albumine et/ou associé à un adjuvant approprié
tel que l’adjuvant de Freund (complet ou incomplet) ou l’hydroxyde d’alumine ; après obtention d’un titre en anticorps
satisfaisant, les anticorps sont récoltés par prélèvement du sérum des animaux immunisés et enrichis en IgG par
précipitation, selon les techniques classiques, puis les IgG spécifiques des protéines du SARS-CoV sont éventuellement
purifiées par chromatographie d’affinité sur une colonne appropriée sur laquelle sont fixés ledit peptide ou ladite protéine,
tels que définis ci-dessus, de façon à obtenir une préparation d’IgG monospécifiques.
[0097] Les anticorps monoclonaux sont produits à partir d’hybridomes obtenus par fusion de lymphocytes B d’un
animal immunisé par une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus avec des myélomes, selon la technique de
Köhler et Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) ; les hybridomes sont cultivés in vitro, notamment dans des fermenteurs
ou produits in vivo, sous forme d’ascite ; alternativement lesdits anticorps monoclonaux sont produits par génie génétique
comme décrit dans le brevet américain US 4,816,567.
[0098] Les anticorps humanisés sont produits par des méthodes générales comme celles décrites dans la Demande
Internationale WO 98/45332.
[0099] Les fragments d’anticorps sont produits à partir des régions VH et VL clonées, à partir des ARNm d’hybridomes
ou de lymphocytes spléniques d’une souris immunisée ; par exemple, les fragments Fv, scFv ou Fab sont exprimés à
la surface de phages filamenteux selon la technique de Winter et Milstein (Nature, 1991, 349, 293-299) ; après plusieurs
étapes de sélection, les fragments d’anticorps spécifiques de l’antigène sont isolés et exprimés dans un système d’expression approprié, par les techniques classiques de clonage et d’expression d’ADN recombinant.
[0100] Les anticorps ou leur fragments tels que définis ci-dessus, sont purifiés par les techniques classiques connues
de l’Homme du métier, telles que la chromatographie d’affinité.
[0101] La présente invention a en outre pour objet l’utilisation d’un produit sélectionné dans le groupe constitué par :
une souche isolée de coronavirus et un polynucléotide tels que définis ci-dessus, pour la préparation d’un réactif de
détection et éventuellement de génotypage/sérotypage, d’un coronavirus associé au SRAS,
[0102] Les Inventeurs décrivent en outre l’utilisation d’un produit sélectionné dans le groupe constitué par : une paire

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